无细胞脂肪组织提取液在皮肤及软组织再生修复中的应用

创伤、感染、肿瘤等各种原因导致的大面积皮肤及软组织缺损是整形外科的常见病,皮肤扩张、皮瓣移植、脂肪组织填充等是组织缺损修复的常用技术手段,而这些技术在应用过程中仍然存在组织扩张速度缓慢、扩张皮肤回缩、移植皮瓣坏死、填充脂肪吸收率高等难题。我们前期建立了从人体脂肪组织中提取无细胞脂肪组织提取液(Cell-free fat extract,CEFFE)技术,该技术可以获得富含各类生长因子而不含活细胞的液体,具有调节炎症、促血管新生、促细胞增殖、抗细胞凋亡、抑制活性氧产生等多种生物学功能。动物实验证实,CEFFE在皮瓣移植、皮肤扩张、脂肪移植、创面愈合、皮肤光老化等疾病中均有治疗效果。本文就CEFFE技术在皮肤及软组织再生修复中的应用及前景进行综述。

胚胎组织提取液影响表皮干细胞表型变化的初步研究

目的:模拟表皮干细胞周围生态微环境,研究表皮干细胞在此环境中的表型变化,表皮干细胞微环境在表皮干细胞"命运"决定过程中的作用。方法:分离、培养表皮干细胞,观察其形态,并进行免疫组织化学鉴定及免疫荧光检测。制备小鼠胚胎组织匀浆液,荧光活细胞示踪法和逆转录聚合酶链式反应检测胚胎组织提取液对表皮干细胞表型变化的影响。结果:原代分离培养的表皮基底层干细胞表达α6、β1整合素、K19、K14、p63、Nes-tin、PCNA为阳性,而K10不表达。激光共聚焦检测显示α6整合素和CD71在表皮干细胞中的分布存在着区域性差异。此外,流式细胞检测显示胚胎组织提取液作用后α6+CD71-表达细胞由细胞总数的22.49%减少至10.92%,而α6+CD71+、α6-CD71+表达细胞则分别由诱导前的62.29%及0.19%增加至诱导后的68.34%及4.51%。RT-PCR结果表明胚胎组织提取液作用后,表皮干细胞中β1整合素、K19、K10表达增强,而K14表达减弱。结论:Ⅳ型胶原黏附法分离的表皮干细胞具有干细胞的特点。α6整合素、CD71在表皮干细胞中分布的区域差异及CD71表达位点的空间变化可以作为区分表皮干细胞及其子代细胞标志之一。胚胎组织提取液对表皮干细胞的增殖分化具有促进作用。胚胎组织提取液中的某些因子可能抑制了K14表达的TA细胞的终末分化,甚至诱导其发生逆向分化,导致诱导后K14的总体表达水平下调。

同种异体富血小板血浆提取液对脂肪干细胞的体外促增殖作用

目的:观察不同浓度同种异体富血小板血浆(PRP)提取液对脂肪干细胞(ADSCs)体外增殖的影响,为将同种异体PRP提取液应用于创面修复提供实验依据。方法:取SD大鼠腹股沟脂肪组织进行原代及传代培养;通过将获得的细胞向脂肪、骨和神经方向诱导分化,鉴定其干细胞特性;三次离心法制备同种异体PRP提取液,加入DMEM/F12配制成6.67%、3.35%和1.67%的培养液;将第3代ADSCs分为4组:实验组(A、B和C组)分别以含体积分数为6.67%、3.35%和1.67%PRP提取液的培养液培养,对照组(D组)ADSCs用仅含10%胎牛血清、DMEM/F12的基础培养液培养;在培养24和48h后采用MTT法观察ADSCs生长状态。结果:原代培养成功获得贴壁生长细胞,呈成纤维细胞样,并成功向脂肪细胞、骨细胞和神经细胞方向诱导分化,即具有多向分化潜能,证明所培养的细胞为ADSCs;酶标仪测定,A、B、C、D组在培养24h后吸光度(A)值分别为0.434 3±0.084 3、0.351 6±0.076 6、0.258 1±0.060 0和0.259 2±0.073 6,在培养48h后A值分别为1.016 8±0.443 6、0.741 7±0.109 7、0.367 8±0.034 2和0.395 7±0.106 2;A组和B组的A值均高于C组和D组(均P<0.05);A组的A值高于B组(P<0.05);C组A值与D组比较差异无统计学意义(P>0.05)。A和B组细胞增殖率明显升高,而C组细胞增殖率呈负增长。结论:适当浓度的同种异体PRP提取液可显著促进ADSCs体外增殖,有望应用于创面修复。

脂肪组织提取液促进大鼠皮肤生长的实验研究

目的 观察脂肪组织提取液对大鼠皮肤体外培养生长的影响。方法 将 2 m m× 2 mm大小的新生大鼠皮肤接种到 2 4孔培养板内 ,分别加入含有体积分数为 10 %脂肪组织提取液 (提取液组 )或体积分数为10 %磷酸盐缓冲液 (PBS组 )的胎牛血清 Dulbecco改良 Eagle培养基培养 6 d,测量皮肤培养后的面积。结果 两组皮肤培养后均有生长 ,脂肪组织提取液组皮肤培养后面积为 (8.4 3± 1.4 0 ) mm2 ,而 PBS组为 (4.18±1.11) mm2 ,脂肪组织提取液组皮肤培养后面积约是 PBS组的 2倍 ,两组间差异有显著性 (P<0 .0 5 )。结论 脂肪组织提取液对皮肤生长有促进作用 ,其机制可能是脂肪组织提取液内含有促细胞增殖的某些生长因子和其他有利于细胞生存的物质。

脑组织提取液促进体外培养神经干细胞增殖

目的:寻找特异性的具有促神经干细胞分裂增殖作用的物质,为神经系统发育研究和神经系统疾病包括脑退行性疾病的治疗研究提供新资料。方法:制备新生鼠的前脑、中脑、后脑及小脑组织提取液,体外培养新生鼠神经干细胞,观察神经球的生长情况,采用MTT细胞活性检测法和特异性蛋白质免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞的增殖能力。结果:中脑和小脑的提取液加入后有大量神经球生成,神经干细胞的特异性蛋白nestin免疫细胞化学染色呈阳性。结论:中脑和小脑的提取液可促进体外培养的神经干细胞增殖分裂,且呈一定量效关系。

水蛭提取液对培养的大鼠脑皮质微血管内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活剂抑制物1的影响

目的探讨水蛭提取液(HEL)对培养的大鼠脑皮质微血管内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物(tPA)、纤溶酶原激活剂抑制物1(PAI-1)的影响。方法建立大鼠大脑皮质微血管内皮细胞培养实验模型。MTT法筛选HEL的有效浓度。检测培养上清液的tPA、PAI-1含量与活性变化,RT-PCR检测经HEL治疗组与生理盐水对照组处理后的微血管内皮细胞tPA与PAI-1的表达,免疫组化检测两组微血管内皮细胞tPA的表达。结果 HEL在一定浓度范围内(0.25～1mg/μl)可促进微血管内皮细胞的生长,有剂量依赖关系(P<0.05)。HEL治疗组较生理盐水对照组能促进培养的大鼠脑皮质微血管内皮细胞分泌tPA,同时提高其活性,促进tPA mRNA的表达及tPA免疫活性表达,且呈剂量依赖性表达增强(P<0.01)。结论 HEL在体外能激活内源性纤溶系统。

脑组织提取液对体外培养雪旺氏细胞影响的观察

目的 :了解脑组织提取液对体外培养雪旺氏细胞的影响。方法 :酶消化法培养的雪旺氏细胞分为对照组和加脑组织提取液组 ,对细胞形态和数量进行观察比较。结果 :体外培养的雪旺氏细胞在加入脑组织提取液后细胞增殖加快 ,并出现细胞突起细长 (为对照组的 2～ 3倍 )、互相延伸等形态学改变。结论 :雪旺氏细胞在接触脑组织提取液后 ,表现为细胞增殖加快 ,突起生长明显的功能活跃状态。

富血小板纤维蛋白渗出液对脂肪干细胞成骨分化及纳米羟基磷灰石支架生物相容性的影响

目的:观察Beagle犬脂肪干细胞在向成骨细胞分化过程中富血小板纤维蛋白(Platelet-richfibrin,PRF)渗出液的作用,及其与支架材料纳米羟基磷灰石支架生物相容性的实验研究。方法:酶消化法获得Beagle犬脂肪干细胞,将收集的富血小板纤维蛋白渗出液分为成骨诱导矿化液组(含成骨矿化液+5%PRF渗出液)、B组对照组(含成骨矿化液的10%FBS的DMEM)和C组空白组(普通10%FBS的DMEM培养液),观察PRF渗出液对成骨的影响,并用环境扫描电镜观察Beagle犬脂肪干细胞与经PRF渗出液孵育的纳米羟基磷灰石支架复合培养后的附着增殖情况。结果:在PRF渗出液的作用下,脂肪干细胞能够更加有效地向成骨细胞分化,形成更多的钙化结节,结节细小致密。环境扫描电镜观察,脂肪干细胞能在支架上充分地附着伸展。结论:PRF渗出液能够有效促进脂肪干细胞向成骨细胞分化,纳米羟基磷灰石三维支架材料具有很好的生物相容性。

脂肪干细胞无细胞提取液的治疗用途:皮肤老化、创面愈合、瘢痕恢复乃至神经再生

背景:脂肪干细胞无细胞提取液包括脂肪干细胞条件培养基、脂肪干细胞外泌体,因其不含细胞,易于携带、储存和运输,已成为当前最热门的治疗方法之一。目的:对脂肪干细胞无细胞提取液治疗用途的研究进展作一综述。方法:以“脂肪干细胞、基质细胞与条件培养基”“脂肪干细胞、基质细胞与外泌体”为中文检索词,“adipose stem cell,adipose stromal cell and conditioned medium”和“adipose stem cell,adipose stromal cell and exosomes”为英文检索词,由第一作者检索2005年1月至2020年3月CNKI、万方、PubMed数据库相关文章。排除重复性及缺乏原创性的文献,计算机初检得到123篇文献,最终保留62篇进行归纳总结。结果与结论:脂肪干细胞无细胞提取液在皮肤老化、创面愈合、瘢痕恢复、神经再生等多个领域具有广泛的治疗潜力,但具体作用机制尚不十分清楚,仍需进行更深入的相关研究。

水蛭提取液对凝血酶诱导血管内皮细胞释放凝血因子的影响

目的 观察水蛭提取液对凝血酶诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）释放血管性血友病因子（vWF）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）、组织型纤溶酶原激活物（t-PA）的影响,探讨水蛭抗凝的作用机制.方法 体外培养 HUVECs,将生长良好的2～3代细胞分为对照组、凝血酶刺激组及水蛭提取液高、中、低剂量组5组.将生药浓度600、300、150 mg/L的水蛭提取液加入到10 kU/L凝血酶刺激的HUVECs培养12 h,对照组加等量RPMI 1640培养液.用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养上清液中vWF、PAI-1、t-PA的含量.结果 与对照组比较,凝血酶刺激组细胞培养上清液中vWF、PAI-1（μg/L）含量显著升高[vWF：（11.01±0.54）%比（7.05±0.49）%;PAI-1：72.26±0.85比55.89±1.26,均P〈0.01],t-PA（μg/L）含量显著降低（15.15±1.41比34.29±1.22,P〈0.01）.与凝血酶刺激组比较,水蛭提取液高、中、低剂量组vWF、PAI-1含量[vWF：（9.48±0.64）%、 （8.57±0.50）%、 （7.97±0.44）%;PAI-1：58.30±0.90、 62.69±1.01、 67.47±1.28]显著降低,t-PA含量（32.59±1.46、 26.40±0.82、 21.06±1.13）显著升高（均P〈0.01）.说明水蛭提取液能显著减弱凝血酶诱导HUVECs释放vWF、PAI-1,增强凝血酶促进HUVECs表达t-PA.结论 水蛭具有明显的抗凝作用,其作用机制可能为参与调节内皮细胞释放vWF,调节纤溶平衡及保护受损的血管内皮细胞.

不同局部肿胀麻醉液对体外培养人脂肪干细胞增殖与成脂分化的影响

背景:获取脂肪术中需要应用不同的局部肿胀麻醉液,其可能会对细胞生物特性产生一定的影响。目的:探讨体外培养条件下不同局部肿胀麻醉液对人脂肪干细胞增殖与成脂分化的影响。方法:取第3代人脂肪干细胞分别用布比卡因、罗哌卡因、利多卡因局部肿胀麻醉液进行培养,对照组用低糖DMEM培养基进行培养,检测各组干预不同时间人脂肪干细胞增殖活性、细胞上清乳酸脱氢酶活性和成脂分化比例。结果与结论:不同局部肿胀麻醉液干预后1,2,3,4,5 d细胞上清乳酸脱氢酶活性值显著高于对照组(P<0.05),布比卡因组显著高于罗哌卡因组、利多卡因组(P<0.05)。各局部肿胀麻醉液组细胞生长吸光度值均低于对照组(P<0.05),且布比卡因组显著低于罗哌卡因组、利多卡因组(P<0.05)。各组人脂肪干细胞成脂分化比例差异无显著性意义(P>0.05)。结果表明,局部肿胀麻醉液(布比卡因、罗哌卡因、利多卡因)均能够抑制人脂肪干细胞增殖,但不会对细胞成脂分化产生明显的影响。

养精胶囊提取液对精原干细胞增殖的影响

背景:临床研究显示补肾填精中药能够促进精原干细胞的增殖和分化。目的:验证养精胶囊提取液对精原干细胞增殖的影响。方法:取雄性小鼠睾丸,分离精原干细胞,用无血清培养液同步化24 h后,加入10,50,100 mg/L养精胶囊提取液24 h,观察对精原干细胞活性、增殖及细胞周期变化。结果与结论:(1)与对照组相比,养精胶囊提取液干预的细胞数量增加、活力增强、S期细胞比例增加,BrdU标记的精原干细胞的数量增加,其中以50 mg/L养精胶囊提取液的效果最为显著;(2)提示养精胶养精胶囊提取液能促进精原干细胞的增殖和促进精原干细胞活力的增加。

肾安提取液对5／6肾切除模型肾组织学的影响

目的 本研究将药物的有效作用部位黄芪甲苷、淫羊藿苷、大黄蒽醌等进行分离提取，观察其复方提取物(肾安提取液)对残余肾模型(RK)肾组织病理学及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法 Wistar雄性大鼠随机分成7组：正常组、假手术组、模型组、肾安2g／kg组、肾安4g／kg组、肾安8g／kg组及尿毒清组行肾大部切除术，在术后3个月每公斤体重分别灌服肾安2g、4g、8g及尿毒清3，6g，假手术及模型组灌服0．9％Nacl 10ml／kg，每日1次，疗程2个月。采用大鼠存活率、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、PCAN及IV型胶原表达(CoIV)等为观察指标。结果 肾安不同剂量组均能明显提高RK模型存活率、能明显降低BUN、SCr(与模型组比较P<0．05，P<0．01)，其中以肾安大剂量组最显著；肾组织积分结果表明，肾安4g／kg组及8g／kg组肾小球及间质纤维化较模型组明显减轻(P<0．05，P<0．01)；免疫组化及半定量分析结果表明上述两组总的肾小球细胞、PCAN阳性细胞数及CoIV表达明显减少(与模型组比较P<0．05，P<0．01)。结论 PCNA表达与肾纤维化呈正相关关系。肾安提取液能减少RK肾组织PCNA表达，抑制纤维化，稳定肾功能，提高存活率，以大剂量组更明显，进一步探索中药提取物对肾纤维化的影响具有重要意义。

鸡卵清提取液不同成分对细胞周期与细胞凋亡的影响

背景:如果一种提取液与细胞共培养后,能增加细胞周期的S期,减少细胞凋亡百分比,则证明这种提取液有促细胞增殖的作用。目的:验证鸡卵清提取液不同组分对293T细胞的增殖及细胞生长周期及细胞凋亡的影响。方法:用超滤管将鸡卵清提取液分离为大于10 ku和小于10 ku和大于3 ku和小于3 ku的成分,用于与细胞共培养,培养3 d后,检测细胞增殖,细胞周期与细胞凋亡情况。结果与结论:鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分有促细胞增殖的作用,同时有促进细胞周期S期百分比增加,细胞凋亡百分比减少的作用。结果提示鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分有促细胞增殖的作用,还有促进细胞周期S期百分比增加,细胞凋亡百分比减小的作用。

不同浓度缺氧预适应小鼠脑匀浆提取液对PC12细胞缺氧耐受性的影响

目的:探讨缺氧预适应小鼠脑匀浆提取液(HP extract)对PC12细胞缺氧耐受性的影响。方法:复制小鼠急性重复缺氧模型,制备HP extract。在培养PC12细胞中加入HP extract使其终浓度分别为0.2、0.8、3.2、6.4、12.8g/L(HP组)。以同浓度正常小鼠脑匀浆提取液(N extract)作为对照组(N组)。缺氧(2%O2)培养24、48、72h后,采用四唑盐(MTT)比色法检测各组细胞活力(A570值)并检测缺氧24、48、72h乳酸脱氢酶(LDH)透出率、缺氧24h早期凋亡率(Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测)、缺氧72h晚期凋亡率(Hoechst33258染色荧光显微镜检测)。结果:HP extract浓度低于6.4g/L(包括6.4g/L),缺氧培养24h时,HP组A570值显著高于同浓度N组,其LDH透出率显著低于同浓度N组。随缺氧时间延长,高浓度HP extract逐渐失去细胞保护作用。至72h时浓度高于6.4g/L(包括6.4g/L)HP extract有促细胞凋亡作用,此时HP组A570值显著低于同浓度N组,其LDH透出率和晚期凋亡率均显著高于同浓度N组。结论:缺氧预适应小鼠脑匀浆提取液对PC12细胞缺氧耐受性的影响呈浓度依赖性和时间依赖性。

杜仲提取液对大鼠血管内皮细胞MMP-2、TIMP-2表达的影响

目的研究杜仲提取液对大鼠血管内皮细胞(VEC)基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)表达的影响。方法收集A、B、C 3组SD大鼠,每组雌雄各5只,分离大鼠原代主动脉,0.2%鼠尾胶原、内皮细胞培养基培养及纯化鉴定,分别用0.4 mg/ml、0.8mg/ml杜仲培养液、高糖型DMEM培养液与生长补充因子(ECGS)共同培养24、48及72 h,收集上清液裂解蛋白,检测MMP-2、TIMP-2的表达。结果 A、B、C组3组间及各组的各培养时间段内MMP-2和TIMP-2的表达差异均有统计学意义(均<0.05),随着培养时间延长、培养液浓度增加MMP-2表达增加,TIMP-2表达下降。结论杜仲提取液可降低大鼠血管内皮细胞MMP-2、增加TIMP-2的表达,参与血管内皮基质的调节,影响血管功能。

脂肪组织来源多能干细胞的心肌分化潜能及意义

脂肪组织提取细胞(PLA细胞)已成为干细胞研究的又一热点。PLA细胞不仅具有容易获取、提取量大、无需特殊血清即可稳定增殖、低水平衰减等特点,且具有多向分化潜能,可定向分化为成肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞等。本文就PLA细胞的概念、提取分离方法、基本特性等进行综述,并探讨其在心脏疾病治疗中的作用及,临床应用前景。

番石榴叶提取物调节白色脂肪组织棕色化作用机制研究

目的:探究番石榴叶提取物调节脂肪细胞分化的作用机制。方法:6周龄雄性SPF级db/db小鼠24只、同龄C57BL/6J正常组小鼠6只,将符合纳入标准的db/db小鼠根据体重、血糖随机分为模型组和番石榴叶提取物高剂量组、番石榴叶提取物中剂量组、番石榴叶提取物低剂量组,并将番石榴叶提取物按高、中、低剂量进行灌胃,于4周后空腹脱臼处死所有小鼠,分别取后腿腓肠肌组织、皮下脂肪组织进行原代成肌细胞、原代脂肪组织SVF细胞的培养、接种和传代。培养48 h后收集细胞并提取蛋白,Western blot法检测各组成肌细胞PGC-1α、FNDC5蛋白和各组脂肪组织SVF细胞Prdm16蛋白的表达。结果:第4周时,与模型组小鼠相比,番石榴叶提取物高剂量组小鼠体重、血糖、低密度脂蛋白降低(均P<0.05)。番石榴叶提取物高剂量组小鼠成肌细胞PGC-1α、FNDC5蛋白表达升高,脂肪组织SVF细胞Prdm16蛋白表达较模型组升高(均P<0.05)。结论:番石榴叶提取物高剂量可通过促进白色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化,提高棕色脂肪水平,从而通过增加机体的能量代谢来调节脂质代谢。

蚯蚓组织中促髓系细胞增殖组分的提取及其性质和作用

用硫酸铵分段盐析、DEAE纤维素-DE52离子交换柱层析、SephadexG100凝胶过滤柱层析等方法．从蚯蚓组织中提取有促髓系幼稚细胞增殖活性的蛋白质，提纯倍数达190倍。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测行5条区带；蛋白酶复印结果显示其中3条具有蛋白酶活性。该活性蛋白质有一定耐热性（55C，60min），促增殖活性强的部分其纤清活性也强。提示该活性蛋白属于蛋白酶，可能是细胞增殖信息传递链的组分或是使传递链组分活化的物质。