高山被孢霉ω-3脂肪酸脱饱和酶基因在麦胚无细胞蛋白质合成系统中的表达

无细胞蛋白质合成系统具有快速、方便等特点,能表达对活细胞具有一定毒性的膜蛋白和抗菌肽,近年来被广泛应用。以来自产油丝状真菌高山被孢霉多不饱和脂肪酸合成途径中的关键膜结合酶——ω-3脂肪酸脱饱和酶为研究对象,构建了适宜体外表达ω-3脂肪酸脱饱和酶的表达载体p IVEX WG1.4-FADS15,并利用麦胚无细胞蛋白质合成系统实现了对该基因的高效表达。同时,通过在麦胚无细胞蛋白质合成过程中添加脂质体的方法,将所表达的膜蛋白正确定位至脂质体磷脂双分子层,以便目标蛋白质的正确折叠。研究结果显示,在此实验条件下目标蛋白质的表达量达1.8 mg/m L,经碘海醇密度梯度超速离心纯化后,该蛋白质的纯度可以达到90%以上。研究结果为后续对该酶进行催化特性研究和蛋白质晶体结构解析奠定了基础。

无细胞蛋白质合成的研究进展

无细胞合成生物学作为新兴的多学科交叉手段,已很好地应用于蛋白质工程领域。因为无细胞生物合成系统无需完整的活细胞,在体外就可激活转录和翻译机器,因此,可减少对细胞的依赖性,从而增加工程的自由度。无细胞系统的这些优点使它已经成为强大的蛋白质工程平台,用于膜蛋白和医药蛋白的合成、非天然氨基酸的嵌入以及高通量分析。无细胞蛋白质合成系统不仅在基础科学研究而且在工业化生产中拥有广阔的应用前景。本文中,笔者系统综述了无细胞蛋白质合成系统的研究及应用,并展望了该系统的研究前景。

无细胞蛋白质合成:从基础研究到工程应用

无细胞蛋白质合成是无细胞合成生物学的技术核心,亦被称为体外蛋白质翻译,是一种用于补充基于细胞的蛋白质表达的技术。无细胞蛋白质合成系统无需完整的活细胞就可以在体外受控环境中模拟整个细胞的转录和翻译过程,并允许对单个成分和反应网络进行详细深入的研究。因此,无细胞蛋白质合成作为一种平台技术,有望克服当前胞内生产系统中因为细胞膜约束带来的表达局限性,在基础科学研究和应用科学研究中具有广阔的前景。无细胞系统操作简单、便于控制,相对于体内蛋白质表达,其优势还包括其开放特性、消除对活细胞的依赖以及将所有系统物质能量集中在目标蛋白质生产上。本文首先概述了无细胞蛋白质合成系统的组成及基于不同组件类型的无细胞蛋白质合成系统的发展,包括以不同生物提取物为基础的系统以及使用重组元素的蛋白质合成体系。之后介绍了以分批反应、连续交换为代表的无细胞蛋白质合成系统的不同反应模式,阐述了无细胞在基因电路、蛋白质工程和人工“生命体系”构建中的应用和研究进展。其中,基因电路主要概述了无细胞技术在原型设计、生物传感、代谢工程三个方面的最新应用;蛋白质工程依次罗列了无细胞技术在膜蛋白、类病毒颗粒、翻译后修饰、非天然氨基酸嵌入以及蛋白质进化等方面的应用拓展;在人工“生命体系”构建中,噬菌体的合成和人工细胞的构筑开辟了新的前沿领域。最后文章分析了无细胞蛋白质合成系统在未来进一步的科学研究和工业化应用中面临的机遇和挑战。

无细胞蛋白质合成系统的研究进展及应用前景

无细胞蛋白质合成系统是现代迅速发展的蛋白质表达系统,以细胞抽提物中酶和蛋白质因子等作为基本反应体系,添加外源模板、底物以及能源物质等维持体系运作,最终在体外合成目标蛋白质。无细胞蛋白质合成系统突破了细胞的生理限制,能够灵活地进行蛋白质合成,极大地提高了蛋白质的产量,不仅可以作为研究转录和翻译的研究工具,而且可以实现蛋白质的高通量表达,在诸多领域带来了突破性的进展。现主要针对无细胞蛋白质合成系统的能量供给、蛋白质的稳定性和折叠修饰以及应用进行综述,以期推动对该技术的理解和应用。

人造细胞内蛋白质合成的研究进展

无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis,CFPS)是一种在体外快速合成目标蛋白质的方法,通过构建含有CFPS系统的人造细胞,能够实现蛋白质的高通量表达和功能性膜蛋白的体外重构.本文详细综述了4种CFPS系统(包括大肠杆菌裂解液、兔网织红细胞裂解液、小麦胚芽提取物、酵母提取物)的适用范围和优缺点,总结了基于CFPS系统构建的人造细胞体系内蛋白质合成的研究现状,以及该领域面临的挑战及未来的发展方向.

法夫驹形氏酵母无细胞蛋白合成系统的条件优化

无细胞蛋白质表达系统在重组蛋白表达、基因表达调控应用、生物检测等方面具有独特优势。文章建立了利用法夫驹形氏酵母细胞裂解物、包含内部核糖体进入位点、T7启动子和poly(A)重组质粒的无细胞蛋白质表达系统,分别优化了该系统中7个组分对绿色荧光蛋白表达的影响,进而利用DSD响应面优化得到该系统的最佳组分浓度,使绿色荧光蛋白的荧光强度增加了3.5倍。该研究结果为法夫驹形氏酵母无细胞系统的进一步应用奠定了理论与数据基础。

膜蛋白的表达:在无细胞体系中实现功能性表达、折叠和组装

膜蛋白在人类和其他物种的生命活动中都起着至关重要的作用.在已完成测序的基因组中,膜蛋白占据30%.药物作用靶向位点、细胞之间的信号传递以及对外界环境的探测等功能,大多是通过生物膜上的特殊膜受体蛋白实现的.膜蛋白研究在工业、环境、国防、医学等领域具有重大意义.嗅觉受体蛋白是一类典型的膜蛋白,属于G蛋白偶联受体家族.嗅觉受体蛋白调控着生物的食物寻找、危险趋避和求偶行为.其主要分布于脊椎动物鼻腔和昆虫触角.嗅觉受体蛋白可以直接识别气味分子,将生物信号转化为电信号,最终传递至神经中枢,进而做出相关应答.膜蛋白的获取并不容易.天然组织中的膜蛋白含量太低不足以支撑学术研究.异源表达难以实现膜蛋白整合上膜,这给膜蛋白的结构和功能研究带来很大挑战.无细胞蛋白质合成系统是一个开放体系,且不依赖细胞活性,是体外表达蛋白质的有效方法.通过无细胞蛋白合成体系,在体外实现膜蛋白二聚体的自组装,将为膜蛋白研究带来全新突破.本文总结了用于无细胞表达的膜蛋白研究进展.

自组装蛋白质芯片--功能蛋白质组学的新工具

传统的蛋白质芯片制备需要进行繁琐的蛋白质表达与纯化。同时,由于蛋白质活性不稳定,蛋白质芯片不宜长期保存。新一代自组装蛋白质芯片,利用无细胞表达体系和DNA固定技术,能够将蛋白质即时、原位表达并固定在芯片上,有效地解决了传统蛋白质芯片的制备和保存问题。目前自组装蛋白质芯片已初步用于大规模蛋白-蛋白质相互作用的筛选,以及鉴定免疫优势抗原等研究。该文介绍了近年自组装蛋白质芯片技术的进展和应用研究。

遗传密码是怎样破译的

文章具体介绍了遗传密码破译的过程:三联体密码的提出;克里克对遗传密码性质的阐述和实验证明;尼伦伯格关于同聚核苷酸对应的氨基酸的发现;奥乔亚关于异聚核苷酸对应的氨基酸的发现;科拉纳关于密码子系列次序的确定;全部密码子的破译及其特征.

合成生物技术在生物传感器中的应用现状与发展趋势

合成生物学通过将标准化的生物元件整合到细胞中,对细胞重新编程以执行新的复杂功能。随着合成生物学各项技术的完善和生物元件的丰富,合成生物技术在生物传感器领域得到了广泛应用。异源合成的生物传感器具有响应快、体积小、成本低、可实现原位监测等优势,在环境控制、疾病监测和食品安全等方面已得到广泛应用。该文对基于合成生物技术的细胞生物传感器和无细胞生物传感器的基本原理及其在检测中的应用进行综述,为合成生物技术更好地应用于生物传感器研究提供参考。

植物NAD-IDH基因克隆及体外表达酶活力分析

植物NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)是一多功能酶.以拟南芥生态型“Columbia gll”及甘蓝型油菜三系“陕2A”,“陕2B”和“垦C1”的叶片为材料,采用RT-PCR方法成功地从每种植物材料中分别克隆了3种NAD-IDH不同亚基基因.同源性搜索发现,来源于油菜的克隆基因是新基因.将克隆基因的功能蛋白编码区整合到pMID1多克隆位点,构建表达重组体,均能在体外翻译系统中高效地表达出特异目的蛋白.亚基0,亚基1和亚基2基因转录本加入到含终浓度为36μg/mL的二硫键异构酶的体外翻译系统,体外表达产物中检测到NAD-IDH酶活力.不同基因种类及转录本分子比的体外表达产物的酶比活力比较表明,NAD-IDH由3种亚基组成,缺一不可,缺少亚基0是致命的,缺少亚基1或2中的任何一个对酶活力的损伤是严重的.同时发现,来源于陕2A和陕2B的亚基1基因转录本中存在碱基缺失现象,从而发生移框突变或无义突变,使突变亚基不表现正常亚基1功能,导致油菜品系间叶片NAD-IDH酶比活力存在差异.