刺猬蛋白和无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族在成骨细胞分化增殖中的作用

骨发生发育受到多种信号转导通路的调节,其中刺猬蛋白(HH)和无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族(WNT)信号转导通路协调成骨细胞的分化、增殖和成熟。本文就HH调节颞下颌关节的发生发育,核心结合因子-A1通过HH调节软骨细胞的增殖和成熟,HH调节梅克尔软骨分化,WNT信号转导通路在神经系统形成、成骨细胞分化增殖和全身骨骼发育中的作用,HH和WNT中的经典的β-连环蛋白促进成骨细胞分化和增殖,抑制软骨细胞和调节细胞分化和增殖等研究进展作一综述。

卷曲蛋白在无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族-卷曲蛋白信号转导通路中的作用

卷曲蛋白（FRZ）最初鉴定于果蝇,因其与无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族（WNT）缠绕在一起而得名,是WNT家族的细胞表面受体,包括三个区域,是G蛋白偶联受体（GPCR）家族中的一员,具有和缺失GPCR的一些基本结构。FRZ信号转导通路分为依赖转录调节因子β-连环蛋白的经典和非经典信号转导通路。FRZ包括FRZ1~10,其调节作用非常广泛,不但在细胞水平上参与调控胚胎发育、干细胞分化和器官形成等过程,而且还在维持组织稳态、再生、塑性和修复中起着重要的作用。FRZ信号转导通路中的激动剂、拮抗剂以及以WNT/FRZ信号转导通路中的共受体,都被假定为潜在的治疗多种癌症、神经退行性变疾病和骨质疏松等重大疾病的靶点。WNT/FRZ相关信号转导通路网非常的复杂,其信号转导通路激活后的结果,潜在机制和相关因子研究都还不够透彻。探究该信号转导通路的特异性,量化其结合反应及系统的定位及其所激活的下游事件是非常重要的,但还需要更多的相关研究来逐步诠释这些问题。

无翅型MMTV整合位点家族蛋白通路在调控脂肪干细胞成骨及成软骨分化中的分子机制

目的探讨无翅型MMTV整合位点家族蛋白(Wnt)通路和SRY相关高迁移率族盒基因9(Sox9)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)相互反馈调节在调控脂肪干细胞(ADSCs)成软骨和成骨分化中的作用机制.方法通过氯化锂(LiCl)、Dickkopf相关蛋白1(DKK-1)刺激ADSCs成软骨及成骨分化,检测早中晚后期成软骨和成骨分化的各项指标如Ⅱ型胶原蛋白(Collagen2a)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、核心结合因子α1(Runx2)、无翅型MMTV整合位点家族蛋白成员5A(Wnt5a)及Wnt通路关键蛋白Sox9、BMP-2、β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)表达情况.随后用慢病毒作为载体,将全长基因序列Sox9和BMP-2基因分别转染进ADSCs使其稳定表达后再次检测相关各项指标的表达水平.应用SPSS 20.0统计软件进行分析,并探讨分子机制.结果ADSCs成软骨诱导分化过程中,Wnt通路早中晚期促进其快速增殖并诱导其成软骨分化.Collagen 2a、Aggrecan的表达早期增高不明显,中晚期明显增高(t=1.484、0.792、8.598、8.788、3.333、8.285,P<0.05);后期则抑制成熟软骨表型并促进软骨肥大和早期软骨骨化;过表达则反馈抑制Wnt通路活性.Sox9表达早中期上调晚期下调(0.14±0.03比0.45±0.09、0.33±0.15比0.84±0.05、0.27±0.02比0.58±0.06,t=5.897,7.726,12.175,P<0.01).成骨诱导分化过程中,Wnt通路前期促进其快速增殖并诱导其成骨分化,Runx2、Wnt5a的表达与对照组比较早期无明显差异(t=0.543、1.755,P>0.05),中晚后期Runx2表达均明显增强(t=13.452、12.148、16.535,P<0.05),而Wnt5a表达均下降(t=-4.017、-19.901、-7.181,P<0.05);过表达则反馈激活Wnt通路,上调β-catenin(0.26±0.08比0.64±0.05,t=8.789,P<0.05),下调Wnt5a(1.35±0.23比0.51±0.26,t=-5.233,P<0.05).BMP-2表达在两组各时期均上调(0.26±0.03比0.64±0.05、0.47±0.03比1.15±0.15、0.63±0.11比1.31±0.09,t=16.340、8.750、29.721,P<0.01).结论Wnt通路分别通过调控Sox9和BMP-2来调节ADSCs成软骨及成骨分化,在诱导分化的不同时期其调控机制明显不同.

2型糖尿病患者血清人无翅型MMTV整合位点家族成员5a与颈动脉内膜中层厚度相关性的初步观察

目的初步观察T2DM患者血清人无翅型MMTV整合位点家族成员5a(Wnt5a)与颈动脉内膜中层厚度(CIMT)的相关性。方法选取2016年6月至2017年5月于苏州大学附属第一医院内分泌科治疗的T2DM患者114例,根据彩色多普勒超声结果分为T2DM合并CIMT≥1.5 mm组(T2DM+CIMT,n=58)及单纯T2DM组(T2DM,n=56),同期选取体检健康者56名为正常对照(NC)组。比较各组血清Wnt5a水平。结果NC、T2DM、T2DM+CIMT组血清Wnt5a水平依次升高[(627.48±290.94)vs(795.82±339.63)vs(1035.84±441.79)pg/ml,P<0.05或P<0.01]。Pearson相关分析显示,血清Wnt5a与年龄、BMI、SBP、DBP、FPG、HbA_(1)c、TC呈正相关(P<0.05或P<0.01),与FIns、HOMA-IR呈负相关(P<0.05)。多元逐步回归分析显示,TC、hs-CRP、FIns是血清Wnt5a的影响因素。结论血清Wnt5a可能参与T2DM及CIMT的发生发展。

血清wnt5a和LC3-Ⅱ联合MELD评分预测慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者短期预后价值探讨

目的探讨血清无翅型MMTV整合位点5a(wnt5a)和微血管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)水平联合终末期肝病模型(MELD)评分预测慢加急性乙型肝炎肝衰竭(HBV-ACLF)患者短期预后的价值。方法2018年1月~2022年12月我院诊治的152例HBV-ACLF患者,常规内科和人工肝治疗,计算MELD评分,采用ELISA法检测血清wnt5a和LC3-Ⅱ水平,应用Logistic回归分析影响HBV-ACLF患者短期预后的因素,应用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清wnt5a和LC3-Ⅱ联合MELD评分预测HBV-ACLF患者短期预后的效能。结果在治疗3个月内,本组HBV-ACLF患者死亡40例(26.3%);死亡组年龄、肝性脑病发生率、INR、血清总胆红素水平、MELD评分和wnt5a水平分别为(51.3±5.1)岁、70.0%、(3.2±0.9)、(441.5±89.7)μmol/L、(28.2±4.3)分和(2.8±1.5)ng/mL,均显著大于生存组【分别为(45.4±4.6)岁、20.0%、(1.7±0.3)、(280.6±73.1)μmol/L、(19.7±2.8)分和(1.3±0.2)ng/mL,P<0.05】,而外周血血小板计数和血清LC3-Ⅱ水平分别为(77.8±10.3)×10^(9)/L和(20.6±2.1)μg/mL,显著低于生存组【分别为(116.4±11.7)×10^(9)/L和(32.5±3.9)μg/mL,P<0.05】;多因素Logistic回归分析显示,年龄大、并发肝性脑病和血清wnt5a升高或血清LC3-Ⅱ水平降低为影响HBV-ACLF患者短期预后的独立影响因素(P<0.05);以MELD评分大于26.9分为截断点,其预测ACLF患者短期死亡的灵敏度和特异度分别为80.0%和92.9%,而检测血清wnt5a和LC3-Ⅱ水平也可以协助判断。结论血清wnt5a和LC3-Ⅱ联合MELD评分对HBV-ACLF患者短期预后具有较好的预测价值。

2型糖尿病患者颈动脉内膜中层厚度与血清无翅型MMTV整合位点家族成员5a及相关因素的关系

目的探讨2型糖尿病(T2DM)患者颈动脉内膜中层厚度(CIMT)与血清无翅型MMTV整合位点家族成员5a(Wnt5a)及相关因素的关系。方法选取2020年9月至2021年12月于河南省人民医院内分泌科住院的T2DM患者为研究对象。检测其血清Wnt5a、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及转化生长因子(TGF)-β1水平,测定其CIMT。依据CIMT将患者分为无增厚组(CIMT<1.0 mm)、增厚组(1.0 mm≤CIMT<1.5 mm)和斑块组(CIMT≥1.5 mm)3组。采用单因素方差分析、Kruskal-Wallis H检验或χ2检验对患者的一般临床资料进行组间比较;采用Spearman相关分析法对CIMT与Wnt5a、IL-6、TNF-α、TGF-β1,以及血清Wnt5a与IL-6、TNF-α、TGF-β1的相关性进行分析;采用多重线性回归分析法分析患者CIMT、血清Wnt5a的影响因素。结果共纳入163例患者。其中,无增厚组60例,增厚组48例,斑块组55例。与无增厚组和增厚组相比,斑块组的CIMT、Wnt5a、IL-6、TNF-α、TGF-β1均更高(均P<0.001)。相关性分析结果显示,CTMI与Wnt5a(r=0.717)、IL-6(r=0.544)、TNF-α(r=0.524)、TGF-β1(r=0.803)均呈正相关(均P<0.001),血清Wnt5a与IL-6(r=0.465)、TNF-α(r=0.453)、TGF-β1(r=0.631)均呈正相关(均P<0.001)。多重线性回归分析结果显示,Wnt5a、IL-6、TGF-β1均是CIMT的影响因素(均P<0.05),IL-6、TGF-β1均是血清Wnt5a的影响因素(均P<0.05)。结论T2DM患者的CIMT与Wnt5a及IL-6、TGF-β1等密切相关。

肝硬化96例血清中微RNA-454和Wnt10a的表达及其临床意义

目的探究肝硬化病人血清中微RNA(microRNA,miR)-454和无翅型小鼠乳腺肿瘤病毒整合位点家族成员10a(Wnt10a)的表达及其临床意义。方法以2018年2月至2020年12月入住武汉科技大学附属汉阳医院的96例肝硬化病人为肝硬化组,并根据Child-Pugh分级分为A级36例、B级31例、C级29例。另选60例健康体检者为对照组。抽取空腹外周血检测天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、丙氨酸转氨酶(ALT)等肝功能指标,qRT-PCR法检测血清中miR-454和Wnt10a表达水平,并分析miR-454、Wnt10a与Child-Pugh分级评分及AST、ALT、ALB等肝功能指标的关系;受试者操作特征(ROC)曲线分析miR-454、Wnt10a对严重肝硬化的诊断效能。结果肝硬化组miR-454表达水平0.85±0.20)显著低于对照组1.46±0.29,Wnt10a表达水平1.67±0.31显著高于对照组0.94±0.23(P<0.05);肝硬化组GGT、CLO、AST、ALP、ALT、TBil水平明显高于对照组,而ALB水平低于对照组(P<0.05);Child-Pugh A级、B级、C级中miR-454表达水平依次降低(P<0.05);Wnt10a在Child-Pugh A级、B级、C级中表达水平逐渐增加(P<0.05);血清miR-454与Wnt10a表达水平呈负相关(r=-0.53,P<0.001);血清miR-454表达水平与ALB呈正相关(r>0,P<0.05),与GLO、TBil、AST、GGT、Child-Pugh分级、ALT、ALP呈负相关(r<0,P<0.05);血清Wnt10a表达水平与ALB呈负相关(r<0,P<0.05),与GLO、TBil、AST、GGT、Child-Pugh分级、ALT、ALP呈正相关(r>0,P<0.05);miR-454、Wnt10a诊断严重性肝硬化的曲线下面积分别为0.80[95%CI:(0.71,0.88)]、0.73[95%CI:(0.621,0.837)];miR-454与Wnt10a联合诊断的曲线下面积为0.84[95%CI:(0.75,0.93)]。结论肝硬化病人血清中miR-454下调表达,Wnt10a上调表达,miR-454和Wnt10a呈负相关性,二者均与肝功能损伤有关,有作为诊断肝硬化严重程度的潜能。

miR-148a-3p靶向Wnt1基因对人牙髓干细胞增殖活力及成骨分化的影响

目的:观察微小RNA(miRNA)-148a-3p对人牙髓干细胞(DPSCs)增殖活力及成骨分化的影响,并探讨可能机制。方法:取对数期DPSCs,分为空白组、NC组、inhibitor组、inhibitor+XAV939[无翅型MMTV整合位点家族蛋白(Wnt)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路抑制剂]组。空白组不处理,NC组转染阴性对照质粒miR-148a-3p NC,inhibitor组转染miR-148a-3p inhibitor,inhibitor+XAV939组转染miR-148a-3p inhibitor并加入XAV939(40μmol/L)。转染48 h后qRT-PCR法检测miR-148a-3p表达量;MTT法检测增殖活力;ELISA法检测碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法检测矿化能力;双荧光素酶实验验证miR-148a-3p靶向基因;Western blot法检测糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-catenin、Runt相关转录因子2(Runx2)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1(DMP-1)以及Wnt1蛋白相对表达量。结果:与空白组、NC组比较,inhibitor组24 h、48 h、72 h吸光度值,GSK-3β蛋白表达量降低,ALP活性值,矿化结节面积占比,β-catenin、Runx2、DSPP、DMP-1以及Wnt1蛋白表达量升高(P<0.05);与inhibitor组比较,inhibitor+XAV939组24 h、48 h、72 h吸光度值,GSK-3β蛋白表达量升高,ALP活性值,矿化结节面积占比,β-catenin、Runx2、DSPP、DMP-1以及Wnt1蛋白表达量降低(P<0.05)。结论:抑制miR-148a-3p表达可提升DPSCs增殖活力并促进其成骨分化,推测其作用机制与负向调控下游的靶基因Wnt1有关。

骨硬化蛋白对牙骨质形成的影响及其机制

骨硬化蛋白是一种含有胱氨酸结的分泌型糖蛋白,可通过骨细胞突触传递至骨表面并作用于周围的成骨细胞,从而降低骨的发生发育速度。其机制在于骨硬化蛋白与无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族蛋白竞争性地结合辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6,促进β-连环蛋白磷酸化并降低β-连环蛋白水平,从而抑制成骨细胞的分化及活性。牙骨质为连接牙体和牙周组织间的桥梁,其功能在于维系牙体的稳固和牙周组织的健康。骨硬化蛋白参与并影响牙骨质的发生发育等各种生理性活动,因此进一步深入探讨骨硬化蛋白这一骨形成负性调控因子与牙骨质间的相互作用和机制,将有助于牙骨质相关再生领域的发展。

替加环素治疗小鼠脓毒症肺损伤的作用及其对Wnt5a与Syndecan-1的影响

目的探讨替加环素治疗小鼠脓毒症肺损伤的作用及其对无翅型MMTV整合位点家族成员5a(Wnt5a)与多配体蛋白聚糖1(Syndecan-1)的影响。方法30只成年雄性BABL/c小鼠随机分为假手术组、模型组和替加环素组,每组10只。采用盲肠结扎穿孔手术对模型组和替加环素组制备脓毒症模型,假手术组术中仅翻动盲肠,但不结扎穿孔。造模3 h后对替加环素组小鼠腹腔注射6.25 mg/kg替加环素,其余两组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水。24 h后处死小鼠并取肺组织。进行苏木精-伊红(HE)染色,记录病理评分;电镜下观察肺血管内皮细胞的病理变化;计算肺湿/干质量比值(W/D);免疫组织化学染色法及Western-blot检测肺组织中Wnt5a与Synde-can-1的表达。结果假手术组小鼠肺泡壁正常,肺泡内无出血,炎症细胞浸润较少。模型组小鼠可见肺泡壁结构破坏,肺泡内有出血,并且可见大量炎症细胞浸润。与模型组比较,替加环素组肺肺部病理损伤减轻。假手术组和替加环素组肺损伤病理评分均低于模型组(P<0.05)。假手术组小鼠肺血管内皮细胞内空泡较少,线粒体无明显肿胀,并且基膜完整。模型组肺血管内皮细胞肿胀,细胞内空泡增加,可见线粒体肿胀,基膜和内皮细胞分离。替加环素可以改善脓毒症小鼠的肺血管内细胞病理变化。假手术组和替加环素组W/D、Wnt5a及Syndecan-1免疫组化检测平均光密度值和蛋白相对表达量均低于模型组(P<0.05)。结论替加环素对脓毒症肺损伤有一定保护作用,并且可以下调Wnt5a和Syndecan-1的表达。

基于Wnt1/β-catenin信号通路观察白藜芦醇对小鼠炎症相关结直肠癌的作用机制

目的基于无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点1(Wnt1)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路观察白藜芦醇对炎症相关性结肠癌(CAC)小鼠的抑制机制。方法采用氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导构建CAC小鼠,实验分为正常组、模型组、实验组、对照组,自造模开始,实验组每日定点腹腔注射100 mg/kg白藜芦醇,每日一次;对照组小鼠每日定点腹腔注射100 mg/kg的β-catenin通路抑制剂(iCRT14),每日一次;正常组、模型组小鼠腹腔注射等剂量的0.9%生理盐水。酶联免疫(ELISA)检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的含量。免疫组化检测结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)的表达。免疫印迹技术(Western-blot)检测小鼠结肠组织中骨髓细胞瘤原癌基因(c-Myc)、Wnt1、β-catenin的表达。结果与正常组相比,模型组小鼠血清中IL-6、TNF-α的含量,以及结肠组织中MPO、c-myc、Wnt1、β-catenin的表达明显升高(P均<0.05);与模型组相比,实验组和对照组小鼠血清中IL-6、TNF-α的含量,以及结肠组织中MPO、c-myc、Wnt1、β-catenin的表达明显降低(P均<0.05)。结论白藜芦醇能够在炎症相关结直肠癌小鼠中发挥抗肿瘤、抗炎性的作用,可能是通过抑制Wnt1/β-catenin信号的激活实现的。

基于Wnt/β-catenin信号通路研究右美托咪定对七氟烷诱发认知功能损伤的保护作用

目的研究右美托咪定对七氟烷诱发认知功能损伤的保护作用及可能机制。方法40只大鼠随机分为空白组、模型组、右美托咪定组及联合组,每组各10只。模型组、右美托咪定组、联合组建立七氟烷认知损伤模型。右美托咪定组、联合组大鼠建模前30 min腹腔注射右美托咪定50μg/kg,联合组另腹腔注射舒林酸5 mg/kg,空白组、模型组静脉注射等量生理盐水。Morris水迷宫测试检测认知功能;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清同型半胱氨酸(Hcy)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平;高效液相色谱仪检测海马组织谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)含量;免疫印迹法检测海马组织糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-连环蛋白(β-catenin)蛋白表达量。结果右美托咪定组大鼠逃避潜伏期短于模型组(P<0.05),穿越原平台次数多于模型组(P<0.05),原平台象限停留时间长于模型组(P<0.05);联合组大鼠逃避潜伏期长于右美托咪定组(P<0.05),穿越原平台次数少于右美托咪定组(P<0.05),原平台象限停留时间短于右美托咪定组(P<0.05)。模型组大鼠血清Hcy、MCP-1水平高于空白组(P<0.05),右美托咪定组低于模型组(P<0.05),联合组高于右美托咪定组(P<0.05)。模型组海马组织GLu含量高于空白组(P<0.05),GABA含量低于空白组(P<0.05);右美托咪定组海马组织GLu含量低于模型组(P<0.05),GABA含量高于模型组(P<0.05);联合组海马组织GLu含量高于右美托咪定组(P<0.05),GABA含量低于右美托咪定组(P<0.05)。模型组海马组织GSK-3β蛋白表达量高于空白组(P<0.05),β-catenin蛋白表达量低于空白组(P<0.05);右美托咪定组海马组织GSK-3β蛋白表达量低于模型组(P<0.05),β-catenin蛋白表达量高于模型组(P<0.05);联合组海马组织GSK-3β蛋白表达量高于右美托咪定组(P<0.05),β-catenin蛋白表达量低于右美托咪定组(P<0.05)。结论右美托咪定可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路改善七氟烷诱发认知功能损伤大鼠的认知功能,减轻炎症反应,增强神经递质活性。

温阳逐瘀汤对肾阳虚证大鼠急性脑缺血损伤后Wnt3a、β-catenin表达的影响

目的:观察温阳逐瘀汤对肾阳虚证大鼠急性脑缺血损伤后缺血脑组织无翅型MMTV整合位点家族成员3A(Wnt3a)、β-连环蛋白(β-catenin)表达的影响,并探讨温阳逐瘀汤防治肾阳虚证大鼠脑缺血损伤的作用机制。方法:将176只雄性SD大鼠分为空白组(Blank组,44只)和肾阳虚组(SYX组,132只);成功建立肾阳虚证大鼠模型后随机分为假手术组(Sham组,44只)、脑缺血模型组(MCAO组,44只)、温阳逐瘀汤组(WYZY组,44只)。WYZY组大鼠灌胃温阳逐瘀汤,MCAO组与Sham组灌胃等体积蒸馏水。各组在术后1 d,运用Zea Longa评分标准进行大鼠神经行为学评分,于术后3、7、14、21 d取材,每个时间选11只大鼠。苏木精-伊红(HE)染色观察神经细胞形态变化;运用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组大鼠血浆环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)含量;免疫蛋白印迹法(Western Blot)检测缺血侧脑组织Wnt3a、β-catenin表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Wnt3a、β-catenin mRNA表达。结果:与Blank组比较,SYX组cAMP含量下降(P<0.05)、cGMP含量升高(P<0.05)。HE染色结果显示,MCAO组细胞排列紊乱、大量细胞坏死、细胞膜消失、细胞核固缩,呈明显的脑缺血损伤表现;WYZY组前期细胞排列紊乱、部分细胞坏死,随着时间的延长,细胞损伤减轻,细胞排列逐渐密集,坏死细胞减少,脑缺血损伤显著改善。与MCAO组、Sham组比较,WYZY组cAMP含量升高,cGMP含量降低(P<0.05)。与MCAO组比较,WYZY组1、3、7、14、21 d神经行为学评分均降低(P<0.05)。与Blank组、Sham组比较,MCAO组、WYZY组缺血脑组织3、7、14、21 d Wnt3a、β-catenin表达均有增加(P<0.05);与MCAO组比较,WYZY组Wnt3a、β-catenin表达均增加(P<0.05),7 d Wnt3a达到峰值,14 dβ-catenin达到峰值。与Blank组、Sham组比较,MCAO组、WYZY组3、7、14、21 d Wnt3a、β-catenin mRNA表达均有增加(P<0.05);与MCAO组比较,WYZY组Wnt3a、β-catenin mRNA表达增加(P<0.05),7 d Wnt3a mRNA达到峰值,14 dβ-catenin mRNA达到峰值。结论:温阳逐瘀汤可改善肾阳虚证大鼠cAMP、cGMP水平及肾阳虚病理状态,可能通过上调Wnt3a、β-catenin表达减轻急性脑缺血损伤,减少神经功能缺损。

卡培他滨联合照射对食管癌裸鼠移植瘤生长及Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的探究卡培他滨联合照射对食管癌裸鼠移植瘤生长、凋亡及无翅型MMTV整合位点家族成员(Wnt)/β-链蛋白(β-catenin)信号通路的影响。方法采用裸鼠皮下接种人食管癌Eca-109细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型。将70只建模成功的裸鼠随机分为对照组、顺铂(5 mg/kg)组、20 Gy(单纯照射,2 Gy/d,5次/w)组、2.67、0.67 mg组(单纯用药2.67、0.67 mg/20 g)、2.67 mg+20 Gy、0.67 mg+20 Gy(用药+照射联合)组,每组10只。用药期间密切观察肿瘤生长情况,计算肿瘤体积、移植瘤体积抑制率;苏木素-伊红(HE)染色观察肿瘤组织基本形态,原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率;实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肿瘤组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA表达;Western印迹检测肿瘤组织Wnt1、β-catenin、糖原合成酶激酶(GSK)3β、癌基因(c-Myc)蛋白表达。结果与对照组相比,其余组瘤体体积及瘤重明显小(P<0.05);肿瘤组织细胞凋亡、Caspase-3、Bax mRNA、GSK3β蛋白表达明显升高,Bcl-2 mRNA表达、Wnt1、β-catenin、c-Myc蛋白表达明显降低(P<0.05)。与20 Gy组、2.67 mg组相比,顺铂组、2.67 mg+20 Gy组、0.67 mg+20 Gy组食管癌裸鼠移植瘤的体积及瘤重显著降低(P<0.05);瘤组织可见大量坏死灶,细胞凋亡率、肿瘤组织Caspase-3、Bax mRNA、GSK3β蛋白表达显著升高(P<0.05),Bcl-2 mRNA表达、Wnt1、β-catenin、c-Myc蛋白表达显著降低(P<0.05);且2.67 mg+20 Gy组对肿瘤的抑制效果明显优于顺铂组(P<0.05)。结论卡培他滨联合照射能显著抑制食管癌肿瘤细胞的生长,诱导肿瘤细胞凋亡,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠海马齿状回神经元树突及Wnt5a/RhoA信号通路的影响

目的探讨左归降糖解郁方治疗糖尿病并发抑郁症的可能作用机制。方法60只大鼠随机分为正常组、模型组、无翅型MMTV整合位点家族成员5a(Wnt5a)激动剂组、左归降糖解郁方组、左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组,每组12只。除正常组外,其余各组大鼠采用高脂饲料饲养、链脲佐菌素注射和慢性温和不可预知应激联用法建立糖尿病并发抑郁症大鼠模型。造模成功后Wnt5a激动剂组大鼠给予双侧海马立体定位注射Wnt5a激动剂Foxy-5各5μl,连续7天;左归降糖解郁方组给予左归降糖解郁方20.52 g/(kg·d)灌胃;左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组进行灌胃给药和双侧海马立体定位注射Wnt5a抑制剂Box5,给药剂量和注射方法同上。正常组和模型组给予10 ml/(kg·d)生理盐水灌胃。各组灌胃均连续4周。干预结束后采用强迫游泳实验(不动时间)和旷场实验(活动次数)评价大鼠的抑郁样行为;检测大鼠的血糖和胰岛素含量,并计算胰岛素抵抗指数;采用高尔基染色观察大鼠海马齿状回神经元的树突形态;采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)注射及免疫荧光检测齿状回神经元增殖水平;采用RT-qPCR和Western blot法检测齿状回Wnt5a、Ras同源物基因组成员A(RhoA)和Rho同源物相关卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)mRNA和蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数均显著升高,不动时间显著延长,活动次数显著减少,海马齿状回中Brdu积分光密度值和Wnt5a、RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达均显著降低(P<0.05或P<0.01);大鼠海马齿状回神经元可见树突分支明显减少或断裂,长度缩短。与模型组比较,左归降糖解郁方组和左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组大鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数显著降低(P<0.05或P<0.01);Wnt5a激动剂组和左归降糖解郁方组大鼠不动时间显著缩短、活动次数显著增加、Brdu积分光密度值显著升高,Wnt5a、RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达均升高(P<0.05或P<0.01),海马齿状回神经元的树突分支数量显著增加、长度延长,树突的复杂性增加。与Wnt5a激动剂组比较,左归降糖解郁方组大鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数显著降低,不动时间显著延长,活动次数显著减少,Brdu积分光密度值显著降低;除左归降糖解郁方组Wnt5a mRNA外,左归降糖解郁方组和左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组Wnt5a、RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达均降低(P<0.05或P<0.01)。与左归降糖解郁方组比较,左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组Wnt5a、RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达均降低(P<0.05或P<0.01)。结论左归降糖解郁方可改善糖尿病并发抑郁症模型大鼠的高血糖和抑郁样行为,其抗抑郁作用可能与激活海马Wnt5a/RhoA信号,促进齿状回神经元树突生长有关。

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨VEGF基因转染骨髓源内皮祖细胞移植治疗大鼠缺血皮瓣的实验

目的分析基于无翅型MMTV整合位点家族(Wnt)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路,血管内皮生长因子(VEGF)基因转染骨髓源内皮祖细胞(EPCs)移植对大鼠缺血皮瓣的治疗作用。方法培养诱导分化大鼠EPCs,脂质体介导VEGF转染EPCs。Wistar大鼠制备缺血皮瓣模型分为对照组、VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、Wnt/β-catenin信号通路激活剂氯化锂(LiCl)组。VEGF-EPCs组与NC-EPCs组皮瓣分别注射PcDNA3.1(+)/VEGF165质粒、PcDNA3.1(+)/NC空载对照质粒,对照组注射PBS溶液,LiCl组注射LiCl。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清VEGF水平;观察大鼠皮瓣存活情况;激光多普勒血液检测仪检测皮瓣蒂部血流;HE染色计算皮瓣毛细血管密度;Western blotting检测皮瓣组织Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达。结果镜下观察分离培养的EPCs外观呈“铺路石”状,经鉴定符合EPCs表面抗原。VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、LiCl组血清VEGF水平、皮瓣存活率、PU值、毛细血管密度高于对照组,且VEGF-EPCs组高于NC-EPCs组、LiCl组,差异有统计学意义(P<0.05),NC-EPCs组与LiCl组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、LiCl组β-catenin、c-myc蛋白相对表达量高于对照组,LiCl组高于VEGF-EPCs组与NC-EPCs组,VEGF-EPCs组高于NC-EPCs组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论VEGF基因转染骨髓源EPCs移植能促进大鼠缺血皮瓣的存活,改善血液循环,增加微血管密度,其机制与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。

DKK3调控羊驼黑色素细胞中黑色素生成

Dickkopf-3(DKK3),Wnt/β-catenin信号通路中一个重要的抑制因子,可能参与调控黑色素生成过程。本文研究了DKK3在羊驼黑色素细胞中黑色素生成的作用。在羊驼黑色素细胞中,过表达DKK3显著下调Wnt1,Lef1,Myc和黑色素生成相关基因MITF及其下游基因TYR,TYRP1和TYRP2的表达,在mRNA和蛋白质水平均明显下降(P<0.05);总黑素,褐黑素和真黑素的含量分别下降80.30%、72.17%和64.60%(P<0.05)。相反,在羊驼黑色素细胞中转染siRNA-DKK3,一种小干扰RNA,可以显著上调Wnt1,Lef1,Myc和黑色素生成相关基因MITF及其下游基因TYR,TYRP1和TYRP2在mRNA和蛋白质水平的表达(P<0.05);总黑素、褐黑素和真黑素的含量分别增加1.65倍、1.25倍和1.21倍(P<0.05)。这些结果表明,DKK3可以通过Wnt/β-catenin信号通路介导MITF下调羊驼黑色素细胞中黑色素的生成。

Wnt5b过表达对小鼠胚胎肝干细胞分化的影响及其对小鼠慢性肝损伤的修复作用

目的探讨重组腺病毒介导的无翅型MMTV整合位点家族成员5b(Wnt5b)基因过表达对小鼠胚胎肝干细胞分化的影响及对小鼠慢性肝损伤的修复作用。方法将表达Wnt5b和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒,分别感染小鼠胚胎肝干细胞HP14-19,诱导其分化,采用Real-time PCR、Western blotting验证Wnt5b的表达,吲哚菁绿(ICG)摄取实验、高碘酸-希夫(PAS)染色检测HP14-19成肝分化能力,Real-time PCR检测肝细胞标志物白蛋白(Alb)和细胞角蛋白18(CK18)的表达;以48只雄性BALB/c小鼠为实验对象,随机分为对照组、模型组、干细胞治疗组及Wnt5b修饰的干细胞治疗组,采用CCl_(4)建立慢性肝损伤模型,干细胞治疗2周后取材,进行肝脏病理染色及免疫组织化学评估肝脏修复情况。结果Real-time PCR及Western blotting检测均显示,Wnt5b在HP14-19中成功过表达(P<0.001);Real-time PCR检测Wnt5b组细胞Alb、CK18的mRNA表达较GFP组及对照组均升高(P<0.001);ICG摄取实验、PAS染色提示,诱导7 d后Wnt5b组细胞ICG摄取能力及糖原合成能力均较GFP组显著增强(P<0.01);肝脏HE染色表明,模型组肝损伤明显,肝脏组织结构紊乱,干细胞组肝脏组织结构部分恢复,Wnt5b组肝组织恢复优于干细胞组;Masson染色显示,模型组有明显的纤维增生,Wnt5b组蓝染纤维较干细胞组更少(P<0.05);免疫组织化学显示Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、髓过氧化物酶(MPO)的表达在模型组明显升高,上述指标在Wnt5b组的表达水平较胎肝干细胞治疗组显著(P<0.05)。结论Wnt5b可诱导小鼠胎肝干细胞向成熟肝细胞样细胞分化,且此基因修饰的胎肝干细胞对慢性肝损伤小鼠肝脏的修复作用较胚胎肝干细胞更有优势。

铝暴露对大鼠PC12细胞tau蛋白异常磷酸化的影响

目的分析铝暴露对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化细胞(PC12细胞)中miR-497-5p、无翅型鼠类乳腺癌病毒整合位点家族成员3a(Wnt3a)、β连环蛋白(β-catenin)、糖原合成激酶-3β(GSK-3β)蛋白和tau蛋白表达的影响,为铝暴露致tau蛋白异常磷酸化的机制研究提供依据。方法体外培养的PC12细胞分别暴露于0、100、200和400μmol/L的Al(mal)3溶液24 h,采用超敏型细胞增殖检测试剂(CCK-8)法检测细胞活力;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测miR-497-5p和Wnt3a基因表达,采用免疫印迹法检测Wnt3a、β-catenin、GSK-3β、P-GSK-3β(Ser9)、tau和P-tau(Ser396)蛋白相对表达量,分析各剂量组目的基因和蛋白的表达趋势。结果PC12细胞活力随铝暴露剂量的增加呈下降趋势(F_(趋势)=323.473,P=0.001)。miR-497-5p相对表达量随铝暴露剂量的增加而上升(F_(趋势)=14.888,P=0.031);Wnt3a基因相对表达量随铝暴露剂量的增加而下降(F_(趋势)=165.934,P<0.001);miR-497-5p相对表达量与Wnt3a相对表达量呈负相关(r=-0.693,P=0.012)。Wnt3a、β-catenin和p-GSK-3β(Ser9)蛋白相对表达量随铝暴露剂量的增加而下降(F_(趋势)=357.656,P=0.001;F_(趋势)=208.750,P=0.001;F_(趋势)=512.583,P<0.001);GSK-3β、tau和p-tau(Ser396)蛋白相对表达量随铝暴露剂量的增加而上升(F_(趋势)=39.965,P<0.001;F_(趋势)=277.929,P=0.006;F_(趋势)=96.247,P=0.002)。结论miR-497-5p表达上升和Wnt3a、β-catenin表达下降,GSK-3β表达上升可能是铝暴露引起tau蛋白异常磷酸化的机制之一。

糖尿病肾病患者血清Wnt5a水平变化及其影响因素分析

目的观察糖尿病肾病患者血清无翅型MMTV整合位点家族成员5a(Wnt5a)水平变化,并分析Wnt5a水平的影响因素。方法选择糖尿病肾病患者100例,根据尿白蛋白与肌酐比值(UACR),将患者分为微量白蛋白尿组(UACR 30~300 mg/g)和大量白蛋白尿组(UACR>300 mg/g)各50例;另选择UACR<30 mg/g的2型糖尿病患者50例作为对照组。采集三组空腹静脉血,采用ELISA法检测血清Wnt5a、转化生长因子β_(1)(TGF-β_(1))、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α),采用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖(FPG),高压液相层析法检测糖化血红蛋白(HbA_(1c)),全自动生化仪检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),化学发光法检测空腹胰岛素(FINS),计算稳态模型评估胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。采用Pearson相关分析法分析血清Wnt5a与炎症因子、血糖、血脂及HOMA-IR的相关性,采用多元线性回归分析血清Wnt5a的影响因素。结果微量白蛋白尿组、大量白蛋白尿组血清Wnt5a水平高于对照组,且大量白蛋白尿组高于微量白蛋白尿组(P均<0.05)。与对照组相比,大量白蛋白尿组、微量白蛋白尿组HbA_(1c)、TC、TGF-β_(1)、IL-6、TNF-α升高,大量白蛋白尿组FPG、HOMA-IR、LDL-C升高(P均<0.05);与微量白蛋白尿组相比,大量白蛋白尿组HbA_(1c)、TC、TGF-β_(1)、IL-6、TNF-α升高(P均<0.05)。相关性分析显示,血清Wnt5a与TGF-β_(1)、IL-6、TNF-α、HbA_(1c)、FPG、HOMA-IR、TC、LDLC、UACR均呈正相关(r分别为0.575、0.544、0.580、0.691、0.631、0.660、0.541、0.535、0.625,P均<0.01)。多元回归分析显示,UACR、HOMA-IR是血清Wnt5a的影响因素。结论糖尿病肾病患者血清Wnt5a水平较不合并肾脏病的糖尿病患者明显升高,且Wnt5a水平与炎症因子、血糖、血脂及胰岛素抵抗水平有关。