中药菟丝子水提取物促毛囊无色素黑素细胞分化的实验研究

目的观察中药菟丝子水提取物诱导毛囊无色素黑素细胞(amelanotic melanocytes,AMMC)分化的作用。方法以8-甲氧补骨脂素(8-MOP)作为阳性对照,选择系列浓度的中药菟丝子水提取物和8-MOP作用于体外培养的AMMC,然后测定酪氨酸酶活性、黑素含量和细胞增殖率的变化。透射电镜观察药物作用前后AMMC超微结构的变化。结果菟丝子水提取物明显促进AMMC生成黑素(P<0.01),且呈浓度依赖性,但是促进作用弱于阳性对照8-MOP(P<0.01)。电镜结果显示,无药物作用的AMMC主要含有I,II和III期黑素小体,药物作用以后,AMMC内出现了大量的IV期黑素小体。菟丝子水提取物对细胞增殖无明显影响,但明显增强酪氨酸酶的活性。结论菟丝子水提取物促进了AM-MC的分化,这种作用与其增强酪氨酸酶活性有关。

维A酸促毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞分化的实验研究

目的:研究维A酸(all-transretinoic acid,ATA)对毛囊无色素黑素细胞(amelanotic melanocytes,AMMC)的激活作用。方法:以高、中、低3种不同浓度的ATA作用于培养的人毛囊外毛根鞘AMMC,倒置显微镜观察细胞形态的变化,细胞计数法测定ATA对AMMC增殖率的影响,通过间接免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜半定量分析药物作用前后AMMC酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrosinase related protein-1,TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)表达的变化。结果:ATA能抑制AMMC的增殖,并能促进AMMC表达TYR和TRP-1,但对TRP-2的表达没有影响。结论:ATA能够促进AMMC的分化,同时抑制增殖,其抑制机制可能与凋亡有关。

人头皮毛囊外根鞘无色素黑素细胞的分离和纯化培养进一步研究

目的从人头皮毛囊外根鞘分离纯化培养无色素黑素细胞。方法采用两步酶法0.50%分离酶和0.50%胶原酶Ⅴ获得游离的毛囊,高浓度0.50%胰酶30min消化游离的毛囊外根鞘细胞,并以优化的培养基进行细胞培养。用HMB-45和NKI/beteb单克隆抗体免疫组化染色、透射电镜对培养物进行鉴定。结果培养物中初始贴壁细胞大多数为无色素黑素细胞,仅有少量的角质形成细胞,无成纤维细胞污染。经二次传代差别胰酶处理很容易去除角质形成细胞。取培养3周的细胞经免疫组化和透射电镜鉴定证实为无色素黑素细胞。传3代后细胞得到完全纯化。结论两步酶法结合高浓度的胰蛋白酶处理细胞可彻底清除成纤维细胞,获得无色素黑素细胞的纯培养。

人表皮黑素细胞、毛囊无色素黑素细胞和鼠黑素瘤细胞的原子力显微镜观察

目的:观察培养的人表皮黑素细胞、毛囊无色素黑素细胞和S91鼠黑素瘤细胞的形态结构。方法:培养并纯化来自正常人包皮的黑素细胞以及来自毛囊的无色素黑素细胞,同时复苏S91细胞株,传代后接种到内置云母片的培养板中,细胞贴附到云母片上后固定,用原子力显微镜扫描观察。结果:正常人表皮黑素细胞有3级分支,在主干及分支的顶端和侧缘可见膨出的球形结构。鼠黑素瘤细胞仅有很短的2级分支,在2级树突近端可见黑素小体。毛囊无色素黑素细胞只有1级树突,并只在树突近端有少数黑素小体。结论:表皮黑素细胞在形态上比黑素瘤细胞、毛囊无色素黑素细胞更成熟,有更多的黑素颗粒从树突的顶端和侧缘以胞吐的形式被输出。

人毛囊无色素黑素细胞培养的纯化和培养基成分对细胞影响的实验研究

目的研究geneticin在毛囊黑素细胞培养过程中对成纤维细胞的去除作用,研究12-O-十四烷佛波酯-13-醋酸酯TPA和含牛垂体提取物BPE角质形成细胞无血清培养基K-SFM对毛囊无色素黑素细胞AMMC形态和增殖的影响。方法通过胶原酶法培养毛囊黑素细胞,观察不同浓度geneticin对污染的成纤维细胞的去除。同时观察不同浓度TPA和含BPE的K-SFM对AMMC形态和促增殖的影响。结果采用100μg/mLgeneticin处理2d后,剩余细胞主要是黑素细胞,其中部分成纤维细胞呈死亡状态,继续培养至第7天后,黑素细胞的纯度达到90%以上。50ng/mLTPA可以促进细胞增殖,与100ng/mLTPA比较差异无显著性(P>0.05),但对细胞形态影响不大;100ng/mLTPA明显促进黑素细胞的树突增加。含20%、40%和80%的K-SFM含BPE培养基中,浓度为80%时促增殖作用最明显。结论100μg/mLgeneticin作用2d去除黑素细胞培养中污染的成纤维细胞是一种简单有效的方法,并可重复使用。在毛囊黑素细胞培养中,TPA以50ng/mL的浓度即可明显促进增殖,而不影响细胞的形态。含BPE的K-SFM可以浓度依赖性地促进AMMC增殖。

人毛囊无色素黑素细胞培养方法的改良及色素生成相关酶表达的研究

目的进一步改良人毛囊无色素黑素细胞(amelanotic melanocytes,AMMC)培养的方法,并研究了AMMC内黑素生成相关酶的表达:酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrosinase related protein-1,TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(tyrosinase related protein-1,TRP-2)。方法采用1%分离酶(dispase)消化分离毛囊,选用含干细胞因子(stem cell factor,SCF)、内皮素-3(endothelin-3,ET-3)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast grow factor,bFGF)和霍乱毒素(cholera toxin,CT)的成黑素细胞培养基培养AMMC,同时培养表皮黑素细胞(melanocytes,MC)作为对照,采用免疫组化、多巴染色和透射电镜对细胞进行鉴定,蛋白印记法分析TYR、TRP-1和TRP-2的表达。结果1%分离酶消化24h可以容易获得游离的毛囊,结合我们所用的培养基完全排除了成纤维细胞的污染。所用成黑素细胞培养基促AMMC增殖明显,细胞可传5代以上。免疫组化结果显示,AMMC表达gp100、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrosinase related protein-1,TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(tyrosinase related protein-1,TRP-2),证明培养的细胞为黑素细胞。AMMC的多巴染色呈阴性,并且透射电镜发现AMMC胞质中仅含大量的I期、II期黑素小体,未见III、IV期黑素小体,因此说明AMMC处于未分化状态。TYR和TRP-1在MC中的表达明显强于AMMC,TRP-2的表达在两种细胞间没有明显差别,进一步说明AMMC与MC具有异质性。结论我们成功培养了完全纯化、快速增殖的AMMC,并且培养的细胞不能生成黑素,生物学性状更接近活体中的状态,其与表皮黑素细胞具有异质性。

1,25二羟基维生素D3对毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞激活的实验研究

目的研究1,25二羟基维生素D3(1,25-Dihydroxyvitamin D3,VID)对毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞(amelanotic melanocytes,AMMC)的激活作用。方法以高、中、低3种不同浓度的1,25(OH)2D3作用于培养的人毛囊外毛根鞘AMMC,倒置显微镜观察细胞形态的变化,然后收集细胞,测定细胞酪氨酸酶活性和黑素含量,透射电镜观察药物作用前后AMMC内黑素小体的变化,最后通过Western blot方法半定量分析药物作用前后AMMC内酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein-1,TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase relatedprotein-2,TRP-2)表达的变化。结果 VID能增加AMMC内酪氨酸酶活性,促进AMMC生成黑素,电镜结果显示药物作用后的AMMC内出现大量Ⅲ、Ⅳ期黑素小体。Western blot结果显示VID可以促进AMMC中TYR和TRP-1的表达,但对TRP-2的表达无明显影响。结论 VID通过促进黑素生成相关酶TYR和TRP-1的表达激活了AMMC。

女贞子乙醇提取物对人毛囊无色素黑素细胞c-kit表达的影响

目的探讨分析女贞子乙醇提取物对人毛囊无色素黑素细胞c-kit表达的影响。方法取体外培养的人毛囊无色素黑素细胞,以不同浓度的女贞子乙醇提取物进行干预,采用显微镜观察和细胞数统计的方法测定女贞子乙醇提取物对无色素黑素细胞增殖的影响,选取最佳浓度。RT-PCR测定最佳浓度下c-kit mRNA的相对表达量,并进行统计分析。结果女贞子提取物可促进毛囊无色素黑素细胞的增殖,最佳浓度为0.22mg/mL,并可对c-kitm RNA表达有显著的促进作用。结论女贞子乙醇提取物可促进体外培养的人毛囊无色素黑素细胞的增殖和c-kit的表达。

内皮素-1对毛囊外根鞘无色素黑素细胞黏附和移行及其细胞骨架形态的影响

目的:体外研究内皮素-1(ET-1)对毛囊外根鞘无色素黑素细胞(AMMC)黏附和移行的作用,并观察其对细胞骨架蛋白微丝、微管的形态影响。方法:3种浓度的ET-1作用体外纯化培养的人AMMC,观察其在细胞外基质蛋白如纤维连接蛋白、层黏连蛋白、Ⅳ型胶原包被培养板上的黏附,以及通过Boyden小室微孔滤膜的情况。采用免疫荧光双重染色法对AMMC分别进行罗丹明(红色)和异硫氰酸(绿色)标记纤维型-肌动蛋白(F-actin)、β微管蛋白,激光共聚焦显微镜观察3种浓度ET-1处理前后AMMC纤维型-肌动蛋白、β微管蛋白形态的变化。结果:与空白对照组相比,ET-1促进了AMMC在纤维连接蛋白上的黏附,20ng/mLET-1作用最明显(P<0.01),而200ng/mL时对细胞的黏附不继续增加。但对层黏连蛋白和Ⅳ型胶原上的黏附无明显影响(P>0.05)。另外,ET-1呈浓度依赖性地促进AMMC通过微孔滤膜。激光共聚焦显微镜观察显示,>20ng/mLET-1可明显促进AMMC胞质中束状应力纤维形成,并集中分布于细胞膜内侧,但对微管结构无明显影响。结论:ET-1在体外可以促进AMMC的黏附和移行,其作用可能与诱导束状应力纤维形成和促进其向细胞膜内侧分布有关。

倍他米松对毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞激活的试验研究

目的:研究倍他米松(betamethasone,BT)对毛囊无色素黑素细胞(amelanotic melanocytes,AMMC)的激活作用。方法:以高、中、低3种不同浓度的BT作用于培养的人毛囊外毛根鞘AMMC,测定药物作用前后酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)活性和黑素生成的变化。通过间接免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜半定量分析药物作用前、后AMMC TYR、酪氨酸酶相关蛋白(ty-rosinase related protein,TRP)-1和TRP-2表达的变化,透射电镜分析黑素小体在药物作用前后的变化。结果:BT促进了AMMC表达TYR和TRP-1,并且以剂量依赖方式促进TYR活性,诱导黑素生成。AMMC主要含有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期黑素小体,但是BT作用后AMMC含有大量Ⅲ或Ⅳ期黑素小体,并且以Ⅳ期黑素小体为主。结论:BT能够激活AMMC,这可能部分解释了糖皮质激素治疗白癜风的机制。

308nm准分子激光联合胡椒碱对毛囊外根鞘无色素黑素细胞黑素合成及酪氨酸酶相关蛋白酶-1、-2蛋白表达的促进作用

目的研究308 nm激光联合胡椒碱对毛囊外根鞘无色素黑素细胞(AMMC)黑素合成及酪氨酸酶相关蛋白酶(TRP)-1、TRP-2蛋白表达的影响。方法体外培养的AMMC细胞分别以联合疗法组、308 nm激光组、胡椒碱组、阳性对照组及空白对照组作用24、72及120 h,测定黑素含量,激光共聚焦显微镜观察并定量分析荧光染色后细胞内TRP-1、TRP-2的表达情况。结果 4组均能促进AMMC细胞黑素量生成。联合治疗组、308 nm激光组、胡椒碱组、阳性对照组均不同程度的促进黑素含量的增加,其中以联合治疗组促进作用最强。胡椒碱呈浓度依赖性促进黑素合成且作用72 h时效果最明显。0.5 mmol/L胡椒碱作用72 h可促进表皮黑素细胞TRP-1表达,而对TRP-2的表达无明显影响。308 nm激光对TRP-1、TRP-2均有促进作用。结论 308 nm激光联合胡椒碱能促进AMMC细胞的黑素合成。

308 nm激光联合胡椒碱对毛囊外根鞘无色素黑素细胞黏附、移行及酪氨酸酶相关蛋白表达的影响

目的:研究308 nm准分子激光(EL)联合胡椒碱对毛囊外根鞘无色素黑素细胞(AMMC)黏附、移行及酪氨酸酶相关蛋白(TRP-1及TRP-2)表达的影响,初步探讨其对AMMC黑素合成影响的作用机制。方法:体外培养的AMMC分别予308nm EL(激光组)、胡椒碱(胡椒碱组)及二者联合(联合干预组)作用72 h、120 h及168 h,同时设阳性对照组及空白对照组。激光共聚焦显微镜观察AMMC黏附及移行情况,并定量分析荧光染色后AMMC细胞内TRP-1及TRP-2表达。结果:与空白对照组比较,其余4组均能不同程度地促进AMMC的黏附及移行。联合干预组、激光组及阳性对照组TRP-1及TRP-2表达均上调,其中联合干预组促进作用最强。胡椒碱作用72 h可促进AMMC细胞内TRP-1表达,且呈浓度依赖性;而对TRP-2的表达无影响。结论:308 nm EL联合胡椒碱具有促进AMMC黏附、移行及提高细胞内TRP-1及TRP-2表达的作用。

干细胞因子结合基质蛋白对毛囊无色素黑素细胞黏附与移行的调节作用

目的:研究干细胞因子(stemcellfactor,SCF)结合基质蛋白对毛囊无色素黑素细胞(amelanoticmelanocytes,AMMC)黏附与移行的调节作用。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞的黏附率。48孔细胞趋化小室测定细胞移行。使用罗丹明标记的鬼笔环肽标记肌动蛋白(F-actin),共聚焦显微镜观察SCF对细胞骨架的调节作用。结果:纤黏连蛋白(FN)、板层素(LN)和Ⅳ型胶原(CⅣ)均以浓度依赖方式促进了AMMC的黏附,其中FN和LN对AMMC促黏附作用相近。SCF减少了AMMC对FN和CⅣ的黏附,对FN的作用更为明显,而对LN起促黏附作用。FN和CⅣ对AMMC有趋化作用,LN无明显作用。SCF作用后可明显使FN对AMMC的趋化作用增强。SCF单独对AMMC有趋化作用,结合FN后,作用明显加强。未黏附在FN上的AMMC胞质内无明显应力纤维;黏附在FN上以后,胞质内可见F-actin排列规则并聚集成束,形成束状应力纤维;SCF作用后,胞体内应力纤维更加致密。结论:SCF调节了AMMC在基质蛋白FN、LN和CⅣ上的黏附与移行,尤其是SCF与FN具有协同促移行作用这可能是白癜风复色过程中AMMC从外毛根鞘向表皮移行机制的一部分。

毛囊内无色素黑素细胞的超微结构特点

目的探讨来自人毛发的毛囊内无色素黑素细胞的超微结构特点。方法胶原酶V消化正常人头皮,获取毛囊。游离毛囊用0．1 mol/L PBS冲洗,胰酶消化,得细胞悬液。将细胞悬液接种到适合黑素细胞生长的培养基。细胞传第3代后,收集细胞,电镜观察摄片。结果透射电镜下可见此细胞为单核圆形或椭圆形细胞,核大,核膜双层,核内常染色体丰富,而异染色质很少。胞质中充满黑素体,多为Ⅱ和Ⅲ期,极少为Ⅰ、Ⅳ期。黑素体内的电子密度颗粒多排列成同心圆形,少数排列呈线状。胞质内高尔基复合体不明显。结论毛囊内无色素黑素细胞超微结构不同于表皮黑素细胞,这种结构变化导致功能上的不成熟,无色素黑素细胞是成熟黑素细胞的贮库。

NB-UVB联合复方白芷酊及卤米松乳膏对进展期白癜风患者AMMC细胞黑素合成量的影响

目的:探究窄谱中波紫外线(NB-UVB)联合复方白芷酊及卤米松乳膏对进展期白癜风疗效及患者毛囊外根鞘无色素黑素细胞(AMMC)黑素合成情况的影响。方法:选取2016年12月-2019年3月在笔者医院皮肤科就诊的70例进展期白癜风患者,随机分成常规组(35例)和联合组(35例)。常规组给予卤米松乳膏+NB-UVB治疗,联合组在常规组的基础上加用复方白芷酊。两组患者均连续治疗24周。观察并比较两组疗效、不良反应发生情况及AMMC细胞黑素合成量。结果:治疗12周时,联合组与常规组总有效率比较差异无统计学意义(82.86%vs 68.57%,P>0.05);治疗24周时,联合组总有效率高于常规组(97.14%vs 80.00%),差异有统计学意义(P<0.05)。两组均有少部分患者出现轻度红斑反应,均在治疗后自行缓解,无其他严重不良反应发生。联合组AMMC细胞黑素合成量为显著高于常规组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:卤米松乳膏+NB-UVB+复方白芷酊对进展期白癜风患者疗效显著,能够提高AMMC细胞黑素合成量,有效促进白斑消退,缓解其临床病症,值得临床推广与应用。