新疆无苞芥Na＋/H＋逆向转运蛋白基因OpNHX1的克隆、表达分析与功能验证

从耐盐植物无苞芥中克隆获得了1个Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1,命名为OpNHX1(GenBank登录号:KC200248)。OpNHX1基因cDNA全长2 153 bp,包含一个1 605 bp的开放阅读框,编码534个氨基酸。系统进化树分析表明,OpNHX1编码产物与拟南芥、小盐芥亲缘关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明,该蛋白基因在无苞芥根、茎、叶、花和荚果中均有表达,其中茎中表达量最高。半定量RT-PCR分析表明,该基因受高盐、干旱、低温及ABA的诱导上调表达。进一步将该基因在拟南芥中过量表达,显著提高了转基因植株在盐胁迫下的存活率,说明OpNHX1基因参与了植物的耐盐性。酵母功能互补试验结果显示,该基因转化酵母Δnhx1后可以补充NHX1的缺失,表明OpNHX1参与Na+/H+的转运。

新疆无苞芥锌指蛋白基因的克隆及表达分析

利用同源克隆法从新疆无苞芥中克隆获得1个锌指蛋白基因(OpZFP)。序列分析表明,OpZFP基因的开放阅读框为684bp,推测编码含227个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,OpZFP蛋白含有1个典型的C2H2型锌指结构,在C端含有一个可能具有转录抑制功能的EAR结构域。系统进化树分析表明OpZFP编码产物与拟南芥AtZFP1、琴叶拟南芥AlZFP1的进化关系较近。分离了OpZFP基因2 095bp的启动子序列,发现该启动子与拟南芥AtZFP1基因的启动子序列只有84.4%的相似性,启动子分析表明二者存在多处不同的顺式作用元件。半定量RT-PCR分析表明,OpZFP在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,在根中的表达量最高。OpZFP基因受高盐、干旱和低温等胁迫的诱导表达,表明该蛋白涉及多种胁迫相关的信号传导途径。

新疆无苞芥类钙调素蛋白基因OpCML13的克隆与分析

通过对无苞芥幼苗cDNA文库的随机克隆测序分析，获得1条与拟南芥编码类钙调素13（calmodulin-likel3，CMLl3）高度相似的EST（GenBank登录号为JZl52285）。利用RT-PCR技术从无苞芥cDNA中克隆了该基因，命名为OpCMLl3，该基因开放阅读框（ORF）为447bp，编码148个氨基酸。生物信息学分析表明，OpCMLl3蛋白的二级结构含有4个ca^2＋结合基序（EF-hands）结构，是一个亲水蛋白，无信号肽，无跨膜区域，为非跨膜蛋白；同源建模发现该蛋白包含8个α-螺旋结构和10个β-转角。系统进化树分析表明，OpCMLl3编码产物与拟南芥AtCMLl3和AtCMI。14进化关系较近，属于同一进化分支。半定量RTPCR结果显示，OpCMLl3基因在无苞芥的不同组织中都有表达，在根中表达量最高；高盐胁迫处理6～24h，OpCMLl3基因的表达明显增强，随后逐渐恢复正常表达水平；低温、干旱和ABA处理6h后基因表达明显上调，并且一直保持较高的表达水平。研究表明，OpCMLl3基因在无苞芥逆境胁迫中可能起着重要作用。

新疆无苞芥OpNAC083基因的克隆与表达分析

本研究通过对新疆耐逆植物无苞芥幼苗c DNA文库的随机克隆测序分析,获得1条与拟南芥NAC转录因子基因At NAC083高度相似的EST序列(Gen Bank登录号为JZ151841),该序列包含1个723 bp最大开放阅读框(ORF),推测编码240个氨基酸。根据该ORF序列设计引物,利用RT-PCR技术从无苞芥叶片的c DNA中克隆了该基因,命名为Op NAC083。比对分析结果表明在其N端具有一段No apical meristem(NAM)保守结构域;该蛋白的二级结构包含33个α-螺旋和11个β-转角。系统进化树分析结果表明,Op NAC083编码产物与拟南芥At NAC083和琴叶拟南芥ANAC083进化关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析基因表达结果显示,Op NAC083在无苞芥的不同组织中都有表达,在叶中表达量最高;高盐胁迫处理2 h、ABA处理6 h明显诱导该基因的表达,但PEG-6000和4℃胁迫却抑制该基因的表达。这表明Op NAC083在无苞芥应对盐和ABA胁迫中可能起着重要作用。

无苞芥NAC转录因子基因OpNAC026的克隆与分析

在新疆耐逆植物无苞芥幼苗cDNA文库的随机克隆测序结果中,发现1条与拟南芥NAC转录因子基因AtNAC026高度相似的5′端EST序列(GenBank登录号为JZ151854),对该克隆进行3′端测序,拼接得到一条全长1 327bp的cDNA序列,该序列包含一个906bp的最大开放阅读框(ORF),推测编码301个氨基酸。根据该ORF序列设计引物,利用RT-PCR技术对其进行克隆,将该基因命名为OpNAC026(GenBank登录号为KM457621)。理化性质分析表明,OpNAC026蛋白是一个无跨膜区域的亲水蛋白,在N端具有一段保守结构域;蛋白质二级结构预测显示,OpNAC026蛋白包含54个α-螺旋和12个β-转角。系统进化树分析表明,OpNAC026基因与拟南芥AtNAC026和AtNAM进化关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析显示,OpNAC026基因在无苞芥的各组织中都有表达,在叶中表达量最高;高盐胁迫处理24h、干旱12h、ABA 6h、4℃低温8h处理均可明显诱导OpNAC026基因的表达。研究表明,OpNAC026基因可能参与无苞芥抗逆机制的调控。

无苞芥锌指蛋白基因OpZFP提高烟草耐盐性的研究

旨在研究C2H2型锌指蛋白在植物生长发育、非生物胁迫信号转导过程中的作用。前期从新疆无苞芥中克隆的一个单锌指基因Op ZFP,利用叶盘法将Op ZFP基因转入普通烟草中。半定量RT-PCR表明,在转基因植株中Op ZFP基因能够高效表达。烟草耐盐性分析显示,在高盐胁迫下,转基因植株的根长要长于野生型植株,且转基因烟草丙二醛(MDA)的含量要明显低于野生型植株;并且高盐胁迫处理,野生型烟草离体叶片叶绿素降解率高于转基因植株。这些结果表明,过量表达Op ZFP的转基因植株可以提高植物对盐胁迫的抗性。

小拟南芥双键还原酶基因OpDBR的克隆及表达分析

从小拟南芥,又名无苞芥(Olimarabidopsis pumila,异种名Arabidopsis pumila)幼苗叶片c DNA文库中获得1条与拟南芥烯醛双键还原酶基因At DBR1(Gen Bank登录号为NP_197202.2)高度相似的EST序列,该序列包含1个1041 bp的最大开放阅读框(ORF),推测编码346个氨基酸(Gen Bank登录号为KU845686)。利用RT-PCR技术从小拟南芥叶片的c DNA中克隆了该基因,命名为Op DBR。比对分析结果表明,该基因属于中链还原/脱氢酶(medium chain reductase/dehydrogenases,MDR)超级家族,具有double bond reductase-like保守蛋白结构域;该蛋白的二级结构包含106个α-螺旋和48个β-转角。系统进化树分析结果表明,Op DBR编码产物与预测的亚麻芥烯醛双键还原酶(Gen Bank登录号为XP_010492631.1)遗传关系最为接近,属于同一进化分支。实时荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)结果显示,Op DBR在小拟南芥的不同组织中都有表达,茎中表达量最高,根中最低。其在200 mmol/L Na Cl、4℃、100μmol/L ABA、20%PEG-6000处理下的表达结果分析显示,该基因可能在小拟南芥应对逆境胁迫时起着重要作用。

新疆小拟南芥NAC转录因子ApNAC055的克隆及表达分析

本研究从新疆特色植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)盐胁迫转录组数据结果中,得到1条与拟南芥NAC转录因子ANAC055(Gene Bank登录号为AEE75683.1)序列高度相似的Unigene。根据ORF序列设计引物,利用RT-PCR技术从小拟南芥叶片c DNA中克隆了该基因的coding sequence(CDS),命名为Ap NAC055。生物信息分析结果表明,Ap NAC055蛋白是1个无跨膜区域的亲水性蛋白,N端具有一段No apical meristem(NAM)保守结构域;该蛋白二级结构包含73个α-螺旋和33个β-转角。系统进化分析结果表明,Ap NAC055与芜菁NAC055进化关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析结果显示,Ap NAC055在小拟南芥各组织中均有表达,在叶片和果荚中表达量均较高,尤其在果荚中;盐胁迫处理可明显诱导Ap NAC055的表达。本研究表明,Ap NAC055可能在小拟南芥耐盐中起重要作用。

小拟南芥实时荧光定量PCR(qRT-PCR)内参基因的筛选

小拟南芥(Arabidopsis pumila),又名无苞芥(Olimarabidopsis pumila),为拟南芥的近缘物种。选择合适的内参基因对于提高实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析基因表达的准确性至关重要。本研究在分析小拟南芥叶片转录组数据的基础上,筛选了12个表达稳定的候选内参基因,包括肌动蛋白1(actin-1,ACT-1)、α-微管蛋白1(α-tubulin,TUA1)、β-微管蛋白6(β-tubulin,TUB6)、翻译起始因子(translation initiation factor 2,IF2)、延伸因子1-α(elongation factor 1-alpha,EF1-α)、聚泛素14(polyubiquitin 14,UBQ14)、UBQ9、泛素连接酶35(ubiquitin-conjugating enzyme 35,UBC35)、转录起始因子1(transcription initiation factor,HAF1)、FK506结合蛋白62(FK506 binding protein 62,FKBP62)、miR319a和醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)。我们分别利用Norm Finder、Genorm和Bestkeeper软件分析了这12个基因在dH_2O、NaCl处理下及小拟南芥不同组织中的表达稳定性。研究表明,在dH_2O处理条件下表达稳定的基因为TUB6和FKBP62,在Na Cl处理条件下为EF1-α和IF2,在组织器官中为HAF1,这些基因适合作为相应试验条件下小拟南芥的内参基因。本研究为小拟南芥基因表达分析提供了可靠的内参基因,具有重要的参考价值。

小拟南芥ApZFP基因异源超表达促进拟南芥开花并提高耐逆性

锌指蛋白(ZFP)是一类重要的转录因子,广泛参与植物的生长发育和非生物胁迫应答。新疆小拟南芥(Arabidopsis pumila)又名无苞芥,是十字花科短命植物,具有高光效、繁殖力强和适应干旱等生物学特征,而且比模式植物拟南芥(A.thaliana)更耐高盐胁迫。将前期克隆的小拟南芥锌指蛋白基因Ap ZFP通过花滴法转化到哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)中,获得了独立表达的转基因株系。表型观察发现,过量表达Ap ZFP基因可促使拟南芥在长短日照下均提前开花。实时荧光定量PCR结果显示,转基因拟南芥株系中,光周期途径中的CO基因和年龄途径中的SPL基因表达上调;春化、环境温度和自主途径中的FLC基因表达下调;编码成花素的基因FT及下游开花相关基因AP1和LFY的表达量均升高。进一步通过盐、干旱和ABA胁迫处理Ap ZFP转基因株系的种子和幼苗,发现在胁迫处理下,与对照相比,转基因拟南芥种子萌发率较高,幼苗主根较长。因此推测,Ap ZFP在植物发育过程中具有多种功能,可能既参与植物的开花转变过程,又同其它植物的锌指蛋白基因一样,参与植物的耐逆过程。