表达单克隆抗体的CHO细胞无蛋白培养基的优化

在自主研发无蛋白培养基的基础上,考察了氨基酸、维生素和葡萄糖对CHO细胞生长、代谢与抗体合成的影响。结果表明,对培养过程中消耗较多的氨基酸进行补充,虽然不能促进细胞生长,但有利于培养后期细胞活性维持与抗体合成;B族维生素的添加能促进细胞生长并延长培养时间;作为重要的碳源和能源,葡萄糖浓度较高时会抑制细胞生长,而浓度较低时不能有效支持细胞生长与抗体合成,维持其在适当浓度有利于细胞生长并能延长培养时间,从而有利于提高抗体产量。通过合理调整各营养物的浓度配比形成了优化的无蛋白培养基,CHO细胞在该培养基中的最高密度达到52.6×105cells mL 1,抗体产量达到274 mg L 1,与初始培养基相比分别提高了33%和63%。总之,在细胞培养过程中应维持充足且平衡的营养物成分,以有效供应细胞生长与抗体合成的需求。

通过高表达Igf1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因组合使CHO细胞适于在无蛋白培养基中抗凋亡培养

哺乳动物细胞表达系统是生产重组蛋白药物最常用的表达系统。但在无蛋白培养基中 ,哺乳动物细胞生长活力差 ,且容易发生细胞凋亡 ,因而难以大规模培养。为解决此问题 ,应用双顺反子表达载体在CHO dhfr- 细胞中同时表达Igf 1 Bcl 2或Bcl 2 CyclinE基因组合 ,通过Bcl 2使细胞获得抗凋亡能力 ;通过Igf 1或CyclinE促进细胞生长分裂 ,使细胞获得在无蛋白培养基中生长的能力。以上述基因组合转染CHO dhfr- 细胞 ,应用Westernblot从G4 18抗性克隆中分别筛选到Bcl 2高表达克隆若干个 ,对其中表达Bcl 2最高的CHO IB3和CHO BC1做进一步Westernblot和流式细胞分析 ,确认此两个细胞株分别高表达Igf 1 Bcl 2和Bcl 2 CyclinE基因组合。分别通过撤去血清和加入放线菌素D诱导细胞凋亡 ,并以流式细胞术和DNALadder法检测细胞凋亡 ,证明CHO IB3和CHO BC1均具有较强的抗细胞凋亡能力。MTT法证明两个细胞株在不含血清的IMDM培养基中的增殖活力显著高于CHO dhfr- 对照细胞。在细胞培养瓶中的连续培养实验表明 ,CHO IB3和CHO BC1在本实验室设计的IMEM无蛋白培养基中的生长速度和活细胞数显著高于CHO dhfr- 对照细胞。提示此两个细胞系能够在无血清培养基中抗凋亡高活力生长 ,适于作为生物工程宿主细胞。

在无血清无蛋白培养基中培养Vero细胞

目的开发在无血清无蛋白培养基(PF)中培养Vero细胞的技术。方法在DMEM/F12培养基中添加酵母提取物和大豆水解物,配制成无血清无蛋白培养基。使用配制好的无血清无蛋白培养基,分别在玻璃、聚乙烯醇缩丁醛(PVB)和聚苯乙烯(PS-TC)培养面上培养Vero细胞,观察细胞生长情况,并绘制细胞生长曲线,以含血清培养基BM为对照。结果与BM培养基比较,在玻璃培养面上,PF培养基不支持Vero细胞生长和分裂;在PVB培养面上,PF培养基支持Vero细胞生长,但不支持分裂;在PS-TC培养面上,PF培养基支持Vero细胞的生长和分裂。结论在PS-TC培养面上,PF培养基适合培养Vero细胞。

Plackett-Burman与响应面法相结合优化化学成分明确的MDCK细胞无血清无蛋白培养基

目的采用Plackett-Burman与响应面法相结合优化化学成分明确的MDCK细胞无血清无蛋白培养基。方法在自主研发的含蛋白无血清培养基的基础上,通过Plackett-Burman试验和响应面试验设计考察23组营养物质对MDCK细胞生长的影响,以细胞比生长速率、维持时间及最大活细胞密度作为响应值进行筛选和定量优化。以最优化的因子浓度配制化学成分明确的无血清无蛋白培养基,分别于细胞培养板和搅拌瓶中培养MDCK细胞,考察细胞比生长速率、维持时间和最大活细胞密度3个响应值的大小。结果通过Plackett-Burman试验筛选出4种对MDCK细胞生长具有显著性促进作用的因子:半胱氨酸、苏氨酸、亮氨酸和葡萄糖,苏氨酸和亮氨酸有助于提高细胞比生长速率,半胱氨酸和葡萄糖有利于提高最大活细胞密度;该化学成分明确的无血清无蛋白培养基能很好地支持MDCK细胞悬浮生长,单细胞悬浮培养MDCK细胞时,细胞比生长速率可达0.058/h,最大活细胞密度可达32.65×105个/ml,分别比基础培养基提高了2.15和3.09倍。结论采用Plackett-Burman与响应面法相结合优化了化学成分明确的MDCK细胞无血清无蛋白培养基,为采用MDCK细胞大规模工业化生产流感疫苗奠定了基础。

无蛋白培养中杂交瘤细胞的生长与单克隆抗体分泌

目的 建立应用无蛋白培养基大量制备单克隆抗体 (McAb)的生产方法。方法 本实验以 3株猪瘟病毒特异单抗杂交瘤细胞为研究对象 ,通过与常规的有血清培养法比较 ,研究了无蛋白培养基中杂交瘤细胞的生长特性、抗体分泌效率、活性与纯度。结果 无蛋白培养基中单抗的产量与效价比有血清培养的单抗高 2～ 4倍 ,而且单抗的纯度显著提高。结论 无蛋白培养基可完全取代常规的有血清培养基 ,用于生产高滴度、高纯度单克隆抗体。

动物细胞培养及单克隆抗体

962115 对CD3-专性单克隆抗体进行PCR克隆和定序[英]/Thirion, S.…//Immunogenetics. -1995, 43(3).-167～168[译自DBA,1996,15(7),96-03879] 使被免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了CD3-专性单克隆抗体。从总RNA开始,从产抗CD3抗体的杂交瘤中制备cDNA。

动物细胞培养及单克隆抗体

980150 单克隆抗体的开发和生产[德]/Baron, D. ∥Pharm. Ztg. -1995,140(5).-9～16[译自DBA,1995,14(6),95-03301] 生产单克隆抗体(MAb)的起始步骤包括免疫接种小鼠以产生适宜水平的抗原特异性淋巴细胞。根据抗原的需求、应用途径、佐剂。

病理学

9927825 无蛋白培养基培养细胞的细胞周期控制因子的异常[日]/土桥洋∥日病理会志.-1997,86(1).-169 冀医情9927826 大鼠细胞周期蛋白 D1基因启动领域的甲基化、脱甲基化引起的基因表达调节机制[日]/北泽庄平∥日病理会志.-1997,86(1).-169