人牙周膜成纤维细胞在无血清培养液中的生长特性

目的 :探讨人牙周膜成纤维细胞在无血清培养液中的生长特性。方法 :用倒置显微镜和MTT法观察人牙周膜成纤维细胞在无血清培养液中的生长和增殖变化。结果 :人牙周膜成纤维细胞在无血清培养液条件下可以生长和增殖 ,但与含血清培养液相比 ,其增殖速率变缓 ,分化明显。结论 :无血清培养液可应用于人牙周膜成纤维细胞的体外培养和实验研究中。

Marc-145细胞无血清培养液组分的优化筛选

目的:对Marc-145细胞无血清培养液组分及浓度进行优化筛选。方法:采用Plackett-Burman设计和中心组合旋转设计对不同的营养成分进行优化筛选。结果:经Plackett-Burman设计,利用20组实验对14种不同营养成分进行考察,发现孕酮、抗氧化试剂、乙醇胺、维生素B6、维生素B12和脂肪酸复合剂对Marc-145细胞无血清悬浮生长的比生长速率有显著影响;针对该6种因素进行中心组合旋转实验设计,利用53组实验筛选出它们的最优使用浓度分别为孕酮5.5 mg/L、抗氧化试剂250μL/L、乙醇胺2.1 mL/L、维生素B122.86 mg/L、维生素B644μg/L和脂肪酸复合剂215μL/L。结论:经2种实验设计方法优化,确定了Marc-145细胞无血清培养液组分及最适浓度,为无血清悬浮培养Marc-145细胞及增殖猪繁殖及呼吸综合征病毒提供了实验基础。

KSOM无血清培养液在绵羊胚胎体外培养应用的研究

本文利用KSOM、TCM-199+20％人血清和KSOM+20％人血清培养绵羊体外受精胚胎,以研究KSOM作为绵羊胚胎体外培养无血清培养液的可能性。实验结果说明,KSOM支持绵羊胚胎早期发育至囊胚期,而在KSOM中添加血清后,胚胎可发育至孵化囊胚,而且孵化囊胚率高于常用的TCM-199+血清(24％vs 7％)(p<0.05)。说明KSOM可以用于绵羊胚胎早期发育的无血清培养液。

无血清培养液流感病毒分离效果分析

目的对比分析有无血清培养液流感病毒分离效果。方法收集流感哨点医院发病3天内流感样病例咽拭子720份,采用荧光定量PCR法检测流感病毒核酸及分型,犬肾细胞(MDCK)培养法进行病毒分离,细胞病变观察和微量血凝实验(HA)检测病毒是否分离成功并测定HA价。结果720份标本中病毒核酸阳性130份,阳性率为18.06%。130份阳性标本,采用含血清培养液病毒分离阳性68份,阳性率为52.31%(68/130),其中H1N1亚型6份,H3N2亚型2份,BV亚型58份,BY亚型2份;无血清培养液病毒分离阳性100份,阳性率为76.92%(100/130),其中H1N1亚型12份,H3N2亚型21份,BV亚型63份,BY亚型4份。两种方法分离差异有统计学意义(χ2=17.23,P<0.01),其中含血清培养液培养后无血凝滴度标本32份,用无血清培养液培养后血凝滴度在1 1~1 256,且BV和BY亚型血凝滴度较高。结论无血清培养液较有血清培养液流感病毒分离效果更好。

无血清培养液培养大肠癌病人外周血来源树突状细胞

目的使用无血清培养液培养大肠癌病人外周血来源树突状细胞（DC）。方法采集大肠癌病人外周血分离出单核细袍。加入分重组人白细胞介素-4和重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子的无血清培养液进行体外诱导培养，培养7d后获得DC。显微镜下观察DC形态，流式细胞仪检测细胞表型CD1a，CD14，CD80，CD83，CD86和HLA—DR的表达。结果无血清培养液培养的细胞呈毛刺状，流式细胞仪检测细胞表达CD1a、CD80、CD86和HLA-DR，不表达CD14、CD83，符合DC的典型特征。结论无血清培养液可以从大肠癌病人外周血诱导培养出DC。

骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖的促进作用

本文通过制备小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液(serum-free murine bone marrow endothelial cell conditioned medium, mBMEC-CM),经超滤分为分子量>10 kDa组分和<10 kDa组分,分别观察mBMEC-CM原液及其组分以及外源性细胞因子对小鼠骨髓内皮细胞集落生成的影响。用Wright’S Giemsa染色计数内皮细胞集落及检测骨髓内皮细胞的vWF,通过[3H]- TdR掺入量,观察mBMEC-CM原液及其组分以及外源性细胞因子对小鼠骨髓内皮细胞增殖的影响,并用分子杂交方法检测内皮细胞表达的细胞因子,从几个方面来研究mBMEC-CM对骨髓内皮细胞增殖的作用。结果显示,骨髓内皮细胞vWF 检测阳性。mBMEC-CM原液及其分子量>10 kDa组分能刺激骨髓内皮细胞集落增殖,且能明显增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR 掺入量;分子量<10 kDa组分对骨髓内皮细胞集落增殖无明显刺激作用,也不能增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量。外源加入IL-6、IL-11、SCF、GM-CSF、VEGF、bFGF 6种细胞因子能明显刺激骨髓内皮细胞集落增殖,SCF、VEGF、bFGF能明显增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量。Atlas array膜杂交实验显示骨髓内皮细胞内源性表达GM-CSF、SCF、MSP-1、endothelin-2、thymosin β10、connective tissue GF、PDGF-A chain、MIP-2α、PlGF、neutrophil activating protein ENA-78、INF-γ、IL-1、IL-6、IL-13、IL-11、inhibin-α等细胞因子的mRNA。上述结果提示,骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖具有促进作用。

无血清培养脐带间充质干细胞的研究

本研究观察无血清培养液培养的人脐带间充质干细胞(UC-MSC),并比较与含10%胎牛血清培养液培养的人脐带间充质干细胞的异同。采集正常足月剖宫产胎儿脐带,用MesenCult-XF无血清培养液或含10%胎牛血清培养液培养。观察不同培养液培养的间充质干细胞细胞的形态、免疫表型、细胞周期、增殖分化潜能及对混合淋巴细胞反应的抑制作用。结果表明,采用无血清MesenCult-XF培养液培养的MSC平均传代倍增6.57±0.7倍,含血清培养液培养的MSC平均传代倍增4,59±0.45倍(P<0.05);两种培养液培养的MSC均表达CD44、CD90、CD73、CD105抗原,不表达CD31、CD45、HLA-DR及CD34等抗原,表达程度无明显统计学差异;无血清培养液培养的MSC(65±5.2)%均为G o/G1期细胞,含血清培养液培养的MSC(62±3.1)%为G o/G1期细胞(P>0.05);两种培养液培养的人脐带MSC均可向成脂细胞、成骨细胞分化;无血清培养液培养的脐带MSC按1 000、5 000、10 000、20 000个细胞/孔接种密度与反应细胞和刺激细胞共培养的每分钟闪烁值(CPM)分别为(6.43±0.47)×104、(4.30±0.38)×104、(1.97±0.13)×104和(0.24±0.03)×104,含血清培养液培养的MSC与不同密度的混合淋巴细胞共培养的CPM值分别为(7.85±0.07)×104、(5.64±0.12)×104、(3.09±0.18)×104和(1.73±0.05)×104。结论:无血清培养液培养的细胞均为MSC,有传代增殖潜能,传代可达临床治疗MSC细胞量,并可避免异种蛋白致敏。

视网膜神经节细胞无血清上清培养液诱导大鼠视网膜干细胞的分化

目的探讨视网膜神经节细胞无血清上清培养液对视网膜干细胞分化的影响。方法分离大鼠视网膜干细胞和视网膜神经节细胞;采用免疫荧光法鉴定体外培养的大鼠视网膜干细胞与视网膜神经节细胞,视网膜干细胞以Nestin抗体进行鉴定,视网膜神经节细胞以Thy-1抗体进行鉴定;以视网膜神经节细胞无血清上清培养液培养视网膜干细胞,以不加入条件培养液培养的视网膜干细胞为对照组,收集分化细胞,采用q PCR法检测Nestin、Pax6、Thy-1及Brn-3的基因表达。结果培养的视网膜干细胞Nestin抗体染色阳性,视网膜神经节细胞Thy-1抗体染色阳性。培养视网膜干细胞72 h后,与对照组相比,无血清上清培养液组细胞Nestin和PAX6基因相对表达量降低,差异均有统计学意义(均为P<0.000 1);Thy-1和Brn-3基因相对表达量升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论视网膜神经节细胞无血清上清培养液能够诱导视网膜干细胞分化为视网膜神经节样细胞。

兔结膜杯状细胞的无血清培养法

目的探索无血清培养系统用于结膜上皮杯状细胞培养的可行性。方法用不含血清培养液进行组织块培养,通过倒置相差显微镜观察细胞形态,并应用特殊组化染色和免疫组化方法对培养杯状细胞进行鉴定。结果倒置相差显微镜下可见在无血清培养液中杯状细胞形态与活体组织中相似,免疫组化法证实部分细胞PAS和MUC5AC呈阳性染色。结论兔结膜杯状细胞可通过无血清培养法在体外培养,并保持活体细胞特性,为进一步研究杯状细胞相关的眼表疾病及药理毒理作用提供有效的细胞模型。

无血清体外培养树突状细胞的研究

本研究的目的是建立对外周血来源的树突状细胞(dendritic cell,DC)的无血清培养方案。以含胎牛血清(FCS)、人AB血清的培养液作为对照。分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMNC),在不同培养液中分别加入GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(500U/ml)培养6天,再分别加入钙离子载体A23187(100ng/ml)继续培养24小时,于倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术分析细胞表型,MTT比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力和DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用。结果表明:无血清培养组培养出典型形态的DC,其表面CD14分子的表达明显减少,CD83、HLA-DR、CDw123分子的表达明显增高,具有明显的刺激同种异体T细胞增殖的能力和DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用。无血清组与两个含血清的对照组比较,组间无显著性差异(P>0.05)。结论:无血清培养液培养的DC与含血清的培养液培养的DC相比,无显著性差异。DC无血清培养具有临床应用前景。

脐带间充质干细胞无血清培养的实验研究

目的建立一种简单的体外无血清培养扩增人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的方法。方法利用酶消化法分离hUCMSCs,在无血清干细胞培养体系下培养扩增,进行形态学观察,CCK-8法分析细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞表面抗原表达及细胞周期,进行成骨、成脂诱导分化。结果 hUCMSCs呈典型的成纤维细胞形态,具有较强的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达,而CD34、CD45呈阴性表达。3周可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用酶消化法和无血清的培养体系能够快速分离培养出大量hUCMSCs,该方法扩增得到的间充质细胞具备稳定的细胞标记物和生长状态,可用于各种治疗的临床试验。

以肝素和抗CD16抗体为基础的扩增人脐血NK细胞无血清培养体系的建立

目的:建立一种新方法以用于体外培养扩增人脐血来源的NK细胞,从而为NK细胞的治疗奠定基础。方法:收集人脐血单个核细胞,将细胞按1.5×10~6/ml悬浮于含5%自体血浆、重组人IL-15(50 ng/ml)和氢化考的松琥珀酸钠(5×10^(-8)mol/L)组成的无血清培养液中,接种于含肝素钠或/和重组抗人CD16单克隆抗体铺板(预先铺板)的培养瓶中,其剂量分别为100 U/cm^2和1μg/cm^2底面积。培养2周后收集细胞,计细胞总数,应用流式细胞术检测细胞中CD3^-/CD56^+比例。以K562细胞为靶细胞,应用MTT实验观察不同效靶比条件下的NK的细胞毒作用。结果:与未铺板培养体系比较,抗CD16抗体及肝素钠铺板体系培养的细胞,在培养1周内易见贴壁的集落。培养2周后,预先铺板组细胞扩增倍数明显高于未铺板组,且CD3^-/CD56^+比例显著升高,尤以抗体和肝素混合铺板组为显著(P<0.01)。MTT实验显示,预先铺板培养组所获得细胞对K562细胞的杀伤活性更强。结论:利用肝素和抗CD16抗体铺板,在培养体系中加入IL-15和氢化考的松,可使NK细胞优势扩增,从而获得纯度较高、细胞毒活性较强的NK细胞。

长程无血清培养人乳腺癌细胞球的生物学特性

目的:从人乳腺癌原代细胞中分离培养乳腺癌干/祖细胞,并通过体外连续传代培养,研究其体外增殖、分化等生物学特性。方法:应用非黏附性乳腺球(mammosphere,MS)悬浮培养法富集乳腺癌干/祖细胞后,通过连续的单克隆实验检测乳腺球细胞(mammosphere-derived cells,MSDC)的克隆形成和自我更新能力,并经血清诱导后观察其分化能力。FCM法检测CD44+/CD24-/low细胞的含量。结果:接种于含生长因子无血清培养液的原发乳腺癌标本细胞均有MS生成,内含具有干细胞特征的肿瘤细胞。随着培养中传代次数的增加,贴壁分化的细胞增多,形成的MS减少,球体变小,且更易贴壁分化。CD44+/CD24-/low细胞仅存在于基底样乳腺癌标本。来自不同标本的MS的生物学特性表现出一定差异。结论:具有自我更新、无限增殖和多向分化等干细胞样特性的肿瘤细胞在人乳腺癌组织中广泛存在,其生物学行为可能因标本来源不同有所差异,也会因环境因素的作用而改变。

小鼠骨髓内皮细胞条件培养液复合FL及TPO对HPP-CFC及CFU-GM增殖的影响

通过传代培养小鼠骨髓内皮细胞 ,收集无血清条件培养液 (ECM) ,并经超滤得到大于 10kD的浓缩液 ,分别观察ECM和大于 10kD的浓缩液复合flt3ligand (FL)及thrombopoietin (TPO)对体外培养HPP CFC、CFU GM的影响。结果表明 :ECM或大于 10kD的浓缩液对HPP CFC、CFU GM的生长均有支持作用 ;FL或 /和TPO与ECM或大于 10kD的浓缩液合用能加强对HPP CFC、CFU GM生长的刺激作用 ;FL加TPO与ECM或大于 10kD的浓缩液合用对HPP CFC、CFU GM生长的刺激作用更加明显 ;选择FL和TPO特异性的引物 ,用RT PCR技术未能检测到小鼠骨髓内皮细胞有FL和TPOmRNA的表达。

维生素E可抑制无血清培养鸡颗粒细胞凋亡

河北农业大学的研究人员研究了维生素E对无血清培养诱导的种母鸡卵泡颗粒细胞凋亡的影响。试验选用健康、有规则产蛋周期的高峰期种母鸡，收集小黄卵泡，分离颗粒细胞。将颗粒细胞经含0．5％的FBS预培养后，用维生素E浓度为10mg／L的无血清培养液继续培养。

人生长素基因工程细胞C-4系的无血清培液培养

C-4工程细胞系是整合有hGH和mMT启动子融合基因的CHO dhfr^-细胞,在cd^(++)作用下能够表达并分泌hGH。该细胞系经过驯化,可适应在CBSF-Ⅱ无血清培液中长期生长、传代,同时仍接受cd^(++)的诱导作用,分泌hGH。CBSF-Ⅱ培液中蛋白含量很低(20μg/ml),为了易于获得高纯度产品和降低费用,用于必须以哺乳动物细胞作为转基因靶细胞生产的生物制品,是值得尝试的。

人近端肾小管上皮细胞的原代培养

目的应用组织块培养法建立人近端肾小管上皮细胞的原代培养方法。方法取肾皮质组织块,应用无血清培养液进行原代培养,融合后用胰蛋白酶-EDTA消化传代。取第三代细胞检测细胞角蛋白、波形蛋白、碱性磷酸酶、结蛋白、Ⅷ因子、α-肌动蛋白的表达,应用扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构。结果融合的上皮单层细胞呈铺路石样表现,伴圆顶(dome)形成。细胞角蛋白、波形蛋白和碱性磷酸酶染色阳性,α-肌动蛋白、Ⅷ因子相关抗原、纤维连接蛋白和结蛋白染色阴性。细胞存在极性,细胞尖端存在短的微绒毛,细胞之间连接紧密。结论应用组织块培养法结合无血清培养液可以成功建立原代人近端肾小管上皮细胞系。

兔结膜上皮细胞组织块培养

目的研究结膜上皮细胞体外培养的方法,并进一步探索无血清培养系统用于结膜上皮细胞培养的可行性。方法分别用含胎牛血清培养液和不含血清培养液进行组织块培养,观察两种培养方法在细胞形态、细胞生长情况和增殖及细胞分化方面的差异。结果无血清培养系统中结膜上皮细胞的增殖、克隆形成及细胞传代能力均较含血清培养系统高,而且具备结膜上皮细胞全部组织结构及功能特点。结论无血清培养系统的组织块培养法可为结膜上皮细胞的疾病、药理毒理研究及培养移植的结膜上皮细胞提供更为安全有效的细胞模型。

利用培养的人发毛囊观察多环芳烃人体代谢个体差异的研究进展

PAH代谢的个体差异在癌研究上的意义 近十年来,不少文献报导利用培养的人体细胞、组织观察到多环芳烃(PAH)人体代谢的个体差异。首先是Kellerman(1973)用培养的人淋巴细胞观察到正常人与支气管肺癌病人的芳烃羟化酶(AHH)诱导活性存在着明显差别。作者将所测得的正常人的AHH诱导活性分成低、中、高三个级别。