无透明带卵母细胞在辅助生殖领域中的研究进展

在辅助生殖技术的操作过程中,实验室在取卵后往往会观察到无透明带卵母细胞,本文就其产生原因、利用价值、辅助生殖过程中处理方式以及相关研究进展等方面进行综述。

无透明带卵母细胞胞浆内单精子注射后成功妊娠分娩一例

在体外受精(IVF)实验室中,经常会遇到无透明带卵母细胞(ZFO)。大多数ZFO是操作过程中损坏造成的,而不是透明带自身产生异常的结果。本文报道1例透明带脱落后的裸卵经胞浆内单精子注射(ICSI)后囊胚移植单胎活产健康婴儿的临床资料,并对卵母细胞透明带的生物学作用、ZFO的临床利用价值进行文献复习和讨论。建议对于那些成熟且形态正常的ZFO,用ICSI方法授精并培养至囊胚期后进行移植或玻璃化冷冻保存,为不孕患者,特别是那些卵母细胞数量有限的患者提供宝贵的胚胎来源。

有无透明带猪卵母细胞电激活参数的优化及体外培养方式的建立

[目的]摸索无透明带猪体外成熟卵母细胞(ZFOs)电激活的条件和无透明带孤雌激活胚胎(ZFEs)的体外培养方式,为手工克隆法生产广西巴马小型猪体细胞核移植奠定基础。[方法]用不同场强、脉冲时程和脉冲次数激活ZIOs、ZFOs,用不同培养方式(微滴法和微穴法)培养ZIEs和ZFEs,检查第7天的囊胚率及囊胚的总细胞数。[结果]有带猪体外成熟的卵母细胞电激活最佳场强和脉冲时程为125 V/(mm.80μs),微滴法培养的囊胚发育率为(30.54±11.06)%;无带猪体外成熟的卵母细胞电激活最佳场强和脉冲时程为85V/(mm.80μs),微穴法培养,其囊胚发育率为(12.77±6.98)%;单次脉冲的激活效果好于多次脉冲。[结论]对有无透明带胚胎的培养方式,微穴法培养无透明带胚胎,微滴法培养有带胚胎较合适,一次脉冲可以有效激活卵母细胞。

无透明带核移植技术

近几年,虽然体细胞核移植研究取得了巨大的成就,但是基本上沿用Willadsen最初的方法——去核、注核、融合和激活。而且所获得的克隆动物往往会出现很多问题如器官发育异常等,其中的原因不清。因此,人们试图革新原有的核移植方法,并建立了新的核移植方法——无透明带核移植法,以期提高核移植的效率及解决核移植中存在的问题。现对无透明带核移植技术的两种方法——反向核移植法和手工核移植法以及单个胚胎培养系统进行介绍。

猪无透明带卵不同孤雌激活方法研究

研究了离子霉素处理时间、处理浓度和不同胚胎基础培养基对猪无透明带卵孤雌激活的影响。结果表明:(1)10μM离子霉素处理5min、7min、10min的激活率64.81%、66.67%、68.75%差异不显著(P>0.05),但显著高于处理3min的激活率36.17%。(2)分别以10μM、15μM离子霉素处理10min的激活率68.18%、65.11%差异不显著(P>0.05),但显著高于5μM的激活率40.54%(P<0.05)。(3)分别以NCSU-23+4%BSA和TCM199+4%BSA作为基础培养基进行培养,其激活率68.51%、62.50%无显著差异(P>0.05)。试验结果表明:10μM离子霉素处理5min联合2mmol/L6-DMAP处理2h激活,以NCSU-23+4%BSA为胚胎基础培养基能有效提高猪无透明带卵孤雌激活的激活率。

卵巢交界性肿瘤术后行体外受精无透明带胚胎培养成功妊娠1例报道并文献复习

1病例简介患者,女,31岁,2016年(28岁)曾因左侧卵巢肿瘤行左侧附件切除术,术后病理示:左侧卵巢交界性黏液性肿瘤,伴局部上皮内癌,附壁结节成分为内胚肉瘤,肉瘤成分为非分化肉瘤。2018年患者右侧输卵管异位妊娠破裂,行腹腔镜右侧输卵管切除术+盆腔粘连松解术。患者既往甲亢病史,口服丙硫氧嘧啶治疗中,随访甲状腺功能正常。2019年因不孕就诊于我院。患者平素月经规律,14岁4~5天/28~30天,量中,无痛经。

猪去核无透明带卵母细胞电融合参数的探讨

试验通过采用不同场强、电场时程和脉冲次数对去核的猪体外成熟卵母细胞电融合参数进行比较研究,观察细胞融合情况。结果表明,在电场时程30μs、1次直流脉冲(DC)的情况下,电场强度0.8kV/cm时卵母细胞的融合率为94.7%,显著高于其他各组(P<0.05);当电场强度为0.8kV/cm、1次直流脉冲的情况下,电场时程60和90μs时,卵母细胞融合率为86.5%和83.8%,差异不显著(P>0.05),但显著低于30μs时的电融合效率(P<0.05);在电场强度为0.8kV/cm,电场时程为30μs的情况下,1次电脉冲激活卵母细胞的融合率(94.7%)和2次电脉冲的融合率(95.6%)无显著差异(P>0.05),但两者显著高于3次电脉冲的融合率(81.7%)(P<0.05)。通过对各组进行比较,在电场强度为0.8kV/cm、电场时程为30μs、1次直流脉冲的电刺激可以对体外成熟的猪卵母细胞取得较好的融合效果。

无透明带体细胞核移植研究进展

目前,体细胞核移植主要还是沿用Willadsen发明的显微操作的去核、注核、融合和激活来完成。由于其核移植效率较低,且对仪器设备和技术人员的要求较高,因此,简化并建立一套更适合于生产条件下的体细胞核移植程序,从而提高核移植效率一直是人们所不懈努力的。作者就无透明带核移植技术和单个胚胎培养系统作一介绍。

表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响

为了观察不同浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响，试验将小鼠原核期胚胎用链霉蛋白酶去除透明带后，分别置于含有不同浓度的表皮生长因子无血清胚胎体外培养液中培养，观察各期胚胎的发育情况。结果表明：除0．01ng／mL表皮生长因子添加组胚胎的2细胞发育率和囊胚回收率与添加0．1ng／mL表皮生长因子处理组差异不显著外（P〉0．05），其体外胚胎各期的发育率、囊胚回收率和囊胚细胞数与其他处理组比较均差异显著（P〈0．05）。说明一定浓度的表皮生长因子可以提高无透明带小鼠胚胎体外培养各期的发育率，但是高浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎的体外发育有一定的抑制作用。

小鼠无透明带胚胎培养方法的优化

目的：探索合适的小凹制作方法以培养小鼠无透明带胚胎，完善WOW（the well of the well）系统，为手工克隆技术提供支持，提高核移植生产效率．方法：对WOW系统进行改进，用金属针、玻璃针及胚胎聚集针分别做小凹，比较这三种方法制作的小凹对小鼠无透明带受精胚胎的培养效果．结果：胚胎聚集针所做小凹的囊胚发育率显著高于金属针及玻璃针所做小凹（55．61％vs44．38％，43．16％）．结论：胚胎聚集针制作的小凹培养小鼠无透明带受精胚胎，囊胚发育率最高．

胞质完整的无透明带卵母细胞临床利用价值探讨

目的探讨胞质完整的无透明带卵母细胞(ZFO)的临床利用价值。方法选取本中心2016年1月至12月接受ICSI治疗的123例不孕症患者,根据卵母细胞有无透明带分为2组:36个ICSI周期中的36枚ZFO作为实验组,87个ICSI周期中749枚透明带完整的成熟卵母细胞作为对照组。比较两组患者一般临床特征、促性腺激素(Gn)用量及天数、HCG日血清雌二醇(E_2)水平及平均获卵数,同时对两组的受精率、双原核(2PN)受精率、异常受精率、卵裂率、囊胚形成率及优质囊胚形成率进行比较分析。结果两组患者的年龄、不孕年限、体重指数(BMI)、基础FSH水平、Gn用量及使用天数、HCG日E_2水平及平均获卵数差异均无统计学意义(P>0.05);实验组与对照组ICSI后的受精率、2PN受精率、异常受精率、卵裂率、囊胚形成率及优质囊胚形成率相比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论无透明带卵母细胞可以正常受精、卵裂并发育为囊胚;若患者在无可利用胚胎的前提下,临床上可以考虑将其利用,以增加患者的累积妊娠率。

无透明带卵母细胞研究进展

随着辅助生殖技术(ART)的广泛应用,控制性超促排卵方案取卵过程中往往会观察到部分胞质完整的无透明带卵母细胞(zona-free oocytes,ZFO),本文就其产生原因、受精方式、培养方法、利用价值等作全面综述。

猪无透明带卵母细胞孤雌激活培养体系的优化

为了探讨猪无透明带卵母细胞孤雌激活培养体系,为手工克隆法生产小猪奠定理论和实验基础,本研究比较了不同浓度链霉蛋白酶对猪卵母细胞透明带的消化率及后期发育的卵裂率;比较了不同电激活参数对无透明带卵母细胞激活效率的影响,并探索了最适宜容纳孤雌激活胚胎的微穴大小。结果表明:2 mg/m L链霉蛋白酶能得到最高的消化率及后期发育的卵裂率;最佳电激活参数为:70 V/mm电压,80滋s脉冲时间,2次脉冲;较适宜容纳孤雌激活胚胎的微穴大小为:底部直径约为l20μm,深度约为150μm。

鼠无透明带核移植技术

体细胞核移植技术是研究动物生殖及再生医学的一个重要工具。同时,也为治疗性克隆及濒危动物的保护提供了一条有效的途径,并且可以提高生产转基因动物的效率。但是传统的体细胞核移植技术成功率低,操作复杂,而且对实验人员的要求较高。无透明带核移植技术(zona-free nuclear transfer technique)则对传统的核移植方法进行了较大的改进,提高了核移植的成功率。

化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

【目的】本研究旨在探索一种崭新的、化学试剂诱导去核卵母细胞为核受体的、无透明带的、手工体细胞核移植方法。【方法】将第一次减数分裂期小鼠卵母细胞进行诱导去核并去除透明带,去核卵胞质与胎儿成纤维细胞粘合、电融合和SrCl2激活后,体外培养重构胚。【结果】重构胚融合率和激活率分别为84.8%和93.6%;胚胎2-细胞发育率为24.7%,4-细胞率为6.74%;2-细胞期克隆胚移植假孕受体后,没有获得怀孕受体;分别以"血清饥饿"胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植,结果表明,冷冻保存细胞的融合率(69.3%)与其余两组(80.6%和84.8%)呈显著差异(P<0.05);激活率、2-细胞和4-细胞发育率,则3组间差异不显著(P>0.05)。【结论】本文将小鼠卵母细胞的化学去核与无透明带技术相结合,获得的克隆胚目前已发育到4-细胞期;另外,供体细胞的3种准备方式均不影响胚胎发育率。该方法属手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,提高核移植总效率。

小鼠卵母细胞化学去核及手工构建核移植胚胎

为优化脱羰秋水仙碱(DC)诱导去核程序,研究以DC去核卵母细胞为核受体的、无透明带体细胞核移植方法在小鼠体细胞核移植中的应用,试验比较了乙醇、SrCl2两种激活方法及脱羰秋水仙碱处理开始时间对小鼠MⅡ期卵母细胞去核效率的影响;将DC诱导去核成功的卵母细胞去除透明带,与胎儿成纤维细胞粘合、电融合和SrCl2激活后,体外培养重构胚。结果显示,7%乙醇激活后0 min起始DC处理可得到最高的诱导去核率(66.4%);而在8 mmol/L SrCl2中激活15 min后用DC处理可得到最高的诱导去核率(64.3%);目前重构胚可以体外发育到8-细胞。试验结果首次证明了SrCl2在小鼠卵母细胞DC诱导去核中的作用效果与乙醇相当,初步证明了将DC诱导去核技术与无透明带技术相结合手工克隆生产小鼠重构胚的可能性,它的成功将大大简化核移植程序。

WOW培养法的研究

WOW培养法是目前培养胚胎的重要方法之一,在去透明带胚胎的培养上尤为重要。将拣卵针烧制成圆球状,在四孔板底烫制WOW,将不同时间去除透明带的牛孤雌激活胚培养于WOW中。结果显示:各组的卵裂率(78.9%、81.1%和78.9%)与对照组无显著差异(P>0.05);移入6-DMAP中之前去除组的囊胚率(31.5%)与移入培养液中之前去除组(32.4%)无显著差异(P>0.05),而且分别与对照组无差异显著(P>0.05);移入离子霉素中之前去除组未得到囊胚。移入6-DMAP中之前去除组囊胚细胞数(113.8±10.1)与移入培养液中之前去除组囊胚细胞数(112.5±8.1)和对照组均无显著差异(P>0.05)。分别5枚、15枚和30枚为一组进行培养,对胚胎的后续发育无显著影响。

核移植方法和维生素C影响绵羊克隆胚胎体外发育

旨在研究绵羊体细胞核移植过程中,不同核移植方法及胚胎培养液中添加维生素C对绵羊克隆胚胎生产效率的影响,为优化绵羊体细胞克隆技术体系提供试验依据。用屠宰场采集的绵羊卵巢为试验材料,经卵母细胞体外成熟后进行核移植操作,采用微电极融合、无透明带克隆与显微注射等核移植方法,比较胚胎构建效率,利用绵羊孤雌胚胎摸索发育液中添加维生素C最适浓度,将该浓度用于克隆胚胎体外培养,统计胚胎发育情况。结果表明:采用25V微电极融合法融合率显著高于平行电极融合法(P<0.05),但与30V电压差异不显著。25V电压微电极融合法死卵率显著低于30V融合法(P<0.05);无透明带构建克隆胚胎的桑椹胚率显著高于显微注射法(P<0.05),但囊胚率差异不显著(P>0.05);胚胎培养液中添加50μmol·L-1维生素C显著提高了孤雌激活与体细胞克隆胚胎囊胚率(P<0.05)。综上所述,微电极融合法可显著提高绵羊体细胞核移植融合效率,无透明带构建方法不能显著提高克隆胚胎囊胚率,胚胎培养液中添加50μmol·L-1维生素C可显著提高绵羊克隆胚胎囊胚率。

化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

卵母细胞的化学去核是采用干扰染色体分离或纺锤体正常功能的化学试剂,使其所有染色质通过纺锤丝牢固结合,并借助极体排出的惯性将所有染色质全部带出胞外,达到去核目的。目前以化学去核处理的MⅡ期卵母细胞为受体,已获得克隆小鼠。然而,第一次减数分裂期的小鼠卵母细胞经化学去核后,进行核移植还未见报道。与传统的机械去核相比,该方法对卵母细胞无机械损伤,完全是极体的自然排放;同时细胞质及其中核重编程相关因子损失量小;而且高效、省时,程序简单,所得的卵胞质或许更适合于供体细胞核的重编程。剪取超排小鼠的卵巢,以注射器刺破有腔卵泡后获得卵母细胞和卵丘细胞复合体,进行体外成熟培养。成熟培养5 h后去除卵丘细胞,挑选生发泡破裂的细胞顺序移入含脱羰秋水仙碱(DC,0.4μg/mL,2 h)和DC(0.4μg/L)+放线菌酮(CHX,50μg/mL)的M16培养液中继续培养,直到第一极体排出。去核卵胞质与胎儿成纤维细胞用植物凝集素(PHA,200μg/mL)粘合后,转入电击槽;施加1个5 V/mm、3μs交流电脉冲和2个92 V/mm、70μs直流电脉冲进行电融合。3 h后,以SrCl2激活6h,于四孔培养皿中制作的“孔中孔”(well of well)体外培养重构胚。试验重复3次,共计698个卵母细胞,获得的重构胚融合率和激活率分别为84.8%和93.6%;胚胎2-细胞发育率为24.7%,4-细胞率为6.74%;2-细胞期克隆胚移植假孕受体后,没有获得怀孕受体。试验分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植,结果表明,冷冻保存细胞的融合率(69.3%)与其余两组(80.6%和84.8%)呈显著差异(P<0.05);激活率、2-细胞和4-细胞发育率,则三组间差异不显著(P>0.05)。本研究将化学去核与无透明带技术相结合,完全丢弃了传统核移植的显微操作及其繁琐程序,属手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,同时提高了核移植的生产力,最终提高核移植总效率。