金纳米颗粒表面催化发夹组装无酶信号放大快速荧光法检测微RNA-721

目的构建一种自催化发夹组装无酶信号放大的靶标快速荧光法,用于检测靶标miRNA。方法首先在金纳米颗粒(AuNP)表面修饰5-羧基荧光素(FAM)标记的DNA发夹探针H1,形成探针AuNP-H1,H1的荧光被AuNP猝灭。加入靶标miRNA会导致AuNP上的H1标记荧光素远离AuNP而重新发射荧光,随后H1与DNA发夹探针H2发生循环自组装,靶标循环被利用,导致荧光信号放大。将探针AuNP-H1、探针H2及不同浓度的miRNA-721共反应后,在480 nm激发波长下测定体系的荧光强度。结果以急性心肌炎生物标志物miRNA-721为模型靶标,在优化的实验条件下使用20μL探针AuNP-H1、50μL 3μmol/L探针H2(退火缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl_(2),pH 7.4)与50μL不同浓度(0.1~5μmol/L)的miRNA-721在30℃共反应20 min,发现在520 nm处的相对荧光强度变化值(ΔF=F-F_(0))与miRNA-721浓度(C)呈良好的线性关系,拟合线性方程为ΔF=29232×lgC-52435(R2=0.9910)。该荧光法检测限为1.23 nmol/L。在正常人血清中的加标回收率为92.71%~104.02%。一次完整的miRNA分析可以在20 min内完成。结论该方法可用于生物样品中miRNA-721的检测,为急性心肌炎的早期诊断提供了一种快速检测手段。

无酶级联催化发夹自组装和杂交链反应信号放大细胞表面特定蛋白糖基化高灵敏成像分析和高效光动力治疗

开发了一种基于邻近诱导的催化发夹组装和杂交链反应(CHA-HCR)的高灵敏度、无酶信号放大策略,用于癌症细胞原位蛋白质特异性糖基化高灵敏荧光成像和高效光动力治疗.设计了2种DNA探针,分别用于靶蛋白和聚糖的特异性标记,其中蛋白探针(PP)通过适配体识别MUC1蛋白,聚糖探针(GP)通过生物正交反应特异性结合唾液酸.由于邻近效应,PP中的CHA起始序列与相邻的GP杂交,并引发随后的CHA-HCR级联反应.最后,在靶蛋白的特定糖基化上形成具有多个荧光分子或光敏剂的延伸双链DNA,实现了细胞表面特定糖蛋白的高灵敏选择性成像分析和肿瘤细胞灭杀,为癌症的诊断和治疗提供了一条通用途径,也为通过靶向特定糖蛋白增强细胞毒效应的光动力治疗提供了工具.该策略为揭示糖基化机制、筛选聚糖相关生物标志物和开发靶向疗法提供了参考.

新型无酶信号放大技术在生物传感器中的应用

为实现低含量生物分子的检测需求,常常需要借助信号放大技术来提高传感器的灵敏度。现有的信号放大技术大致可以分为酶辅助的信号放大及无酶信号放大这两类。酶固有的稳定性差、反应条件苛刻等缺点使酶辅助信号放大技术在应用上受到了一定的限制。无酶信号放大技术则不需要苛刻的实验条件且操作简单,因此受到了人们的广泛关注。该文主要就新型无酶信号放大技术在生物传感器中的应用作一综述。

基于DNA酶的铀酰离子传感方法

铀在核能发展中扮演着十分重要的角色,铀污染的防治是一个必须解决的问题,因此对铀酰离子(UO_2^(2+))的检测方法研究,成为了人们关注的热点。DNA酶具有高度的特异性识别能力,是一种理想的生物探针。本文简要介绍了DNA酶的结构特征,概述了近期发展的基于DNA酶的UO_2^(2+)传感方法,包括比色法、荧光法、表面增强拉曼光谱法、共振光散射法和电化学法等,主要介绍了杂交链反应和目标催化发卡组装两种无酶放大技术。DNA酶的使用使得传感器对UO_2^(2+)的检测能力基本上在纳摩尔量级,展现出很高的灵敏度,结合生物无酶放大技术后,传感器的性能得到数量级的提高。在未来传感技术简单、快速、灵敏和便携的趋势下,基于DNA酶的传感器具有非常广阔的应用前景。

基于阳离子共轭聚合物荧光共振能量转移结合杂交链式反应信号扩增检测端粒酶活性

检测端粒酶活性对肿瘤、癌症的早期诊断,以及开发以端粒酶为靶标分子的抗肿瘤、抗癌药物具有重要意义。本研究基于阳离子共轭聚合物Poly[(9,9-bis(6'-N,N,N-trimethylammonium)hexyl)fluorenylene phenylene(PFP)与荧光染料SYBRGreenI(SG)之间的荧光共振能量转移,建立了一种简单快速的端粒酶活性检测方法。当端粒酶存在时,引物探针被延伸,生成具有-(GGTTAG)n重复序列的DNA。然后通过链霉亲合素与生物素的特异性作用将端粒酶延伸产物连接在磁性微球上。加入与端粒酶延伸产物匹配的探针-(CTAACC)2。端粒酶延伸产物形成双链结构之后加入SG,SG能够特异性的嵌入到DNA双链结构中。最后,加入PFP。PFP是一种带有正电荷的水溶性共轭阳离子聚合物,可以通过静电作用与双链DNA发生吸附。PFP与嵌入在双链结构中的SG发生荧光共振能量转移(FRET)。根据FRET的效率可以实现对端粒酶活性的定量检测。本方法可以检测到3.0×10^5个Hela细胞中提取的端粒酶活性。将本方法与杂交链式反应(HCR)反应结合,可实现检测信号的放大,提高检测的灵敏度,可以检测到6.0×10^4个Hela细胞中的端粒酶活性,灵敏度提高了一个数量级。本方法简单、快速,无需标记、扩增过程,无酶参与,检测成本低,灵敏度高。

催化发夹组装用于碱基切除修复酶活性检测研究

碱基切除修复酶在DNA损伤修复过程中具有重要作用,且其检测与癌症等疾病的诊断相关。传统的碱基切除修复酶检测方法操作复杂、灵敏度低,且仅对酶的浓度进行定量分析而非酶的活性。为此,建立了基于催化发夹组装介导信号放大用于核酸内切酶IV(Endo IV)活性的检测方法。该方法利用Endo IV的活性作用于底物探针,将引发序列释放而引发催化发夹自组装信号放大,以实现Endo IV的活性检测分析。通过荧光检测实验可知,该方法检测下限为3.7×10-7 U/mL,可选择性地对Endo IV的活性进行检测,是一种设计简单、操作简便、灵敏度高的碱基切除修复酶活性检测方法。

基于杂交链式反应信号放大和磁分离技术荧光检测端粒酶活性

端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶,它一般在癌细胞中被激活.它与端粒DNA的不断复制以及癌细胞的不断增殖密切相关.所以检测端粒酶的活性对癌症的早期诊断以及以端粒酶为靶标分子的抗癌药物的开发具有重要意义.利用杂交链式反应（HCR）无酶放大检测信号,建立了一种简单、快速的端粒酶活性检测方法.端粒酶延伸产物是一条末端具有（ggttag）_n重复序列的DNA.在实验过程中,通过链霉亲合素与生物素的特异性作用将端粒酶延伸产物连接在磁性微球上.设计一条端粒酶延伸产物特异性的DNA探针I作为杂交链式反应的引发探针.DNA探针I的3′-端与端粒酶延伸产物的重复序列匹配,通过杂交,DNA探针I被固定在磁球上;DNA探针I的5′-端引发DNA探针II和探针III发生杂交链式反应.DNA探针II和探针III上都标记有荧光基团,可以利用荧光直接进行信号检测.在反应过程中,通过磁分离去除多余未反应的三种DNA探针.在优化条件下,可以检测到1.0×10~5个Hela细胞中的端粒酶活性.该方法简单、快速、检测成本低,分析全程无酶参与,在肿瘤或癌症的临床诊断以及以端粒酶为靶标分子的抗癌药物的筛选上具有广阔的应用前景.