无饲养层培养人胚胎干细胞方法的建立

人胚胎干细胞(humanembryonicstemcell,hES细胞)是当前医学研究的热点之一.然而hES细胞培养条件苛刻,通常需要采用鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast,MEFs)饲养层来维持其未分化状态,成为目前hES细胞研究的瓶颈之一.本实验成功地将hES细胞接种在细胞外基质包被的六孔板上培养,传代20次后细胞仍然保持良好的未分化状态,各种hES细胞生物学特性(如表面标志物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81,OCT-4,碱性磷酸酶及体内外分化潜能等)均无改变;其冻存、复苏效果与生长在饲养层上的hES细胞无明显差异.因此,该无饲养层培养体系可以用于培养hES细胞,并为hES细胞转基因研究及大规模培养打下良好的基础.

人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立

背景:研究表明FGF2,TGFβ/activin/nodal和IGF信号通路是人胚胎干细胞保持其多能性所必需的,然而直接添加外源性碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和胰岛素是否能够维持人胚胎干细胞的自我更新目前尚无报道。目的:拟建立人胚胎干细胞无饲养层无血清条件下的培养体系。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09/2009-02在中国科学院昆明动物研究所完成。材料:12.5～13.5d龄清洁级ICR孕鼠2只,由昆明医学院动物中心提供。人胚胎干细胞株BG02购自美国Bresagen公司。方法:①消化离心BG02细胞,重悬于无饲养层过渡培养基后接种,常规培养5～7d,挑去分化的人胚胎干细胞,加入分散酶消化,切割成小团块,离心重悬后按1∶3比例重新接种预铺层粘连蛋白的4孔板,此时培养基换成无血清无饲养层培养基,由80%DMEM/F12、20%KSR、2mmol/Lglutamine、1%非必需氨基酸、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、ITS(×1)、106U/L青霉素、100mg/L链霉素、4μg/L碱性成纤维细胞生长因子、0.12μg/L转化生长因子β1组成。②无菌条件下取出ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,接种在0.1%明胶包被的6孔板中即为饲养层。将生长在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞株BG02预铺至有层粘连蛋白的培养板上,加入含碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1及ITS的无血清培养基连续培养。主要观察指标:观察BG02细胞在无血清无饲养层培养体系中的形态,采用细胞免疫组化法检测人胚胎干细胞特异性分子标志的表达,检测BG02细胞体外分化能力及其核型,比较BG02细胞在无血清无饲养层和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系中的生长情况、细胞集落分化率。结果:在无血清无饲养层培养体系中,BG02细胞连续传代20代,细胞呈典型的人胚胎干细胞形态特征;BG02细胞表达SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81,Oct-4,但不表达SSEA-1;培养20d后,BG02细胞进一步分化成3个胚层的细胞,分化细胞能够表达甲胎蛋白、巢蛋白、α-肌动蛋白;培养至20代细胞核型均正常(46XY)。与在饲养层培养体系下比较,无血清无饲养层条件下BG02细胞BG02细胞生长速度减慢,细胞倍增时间明显延长(P<0.05),集落分化率明显升高(P<0.05)。结论:实验初步建立了人胚胎干细胞无血清无饲养层的培养体系,添加碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和ITS可以维持人胚胎干细胞的自我更新。

人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立

目的拟建立人胚胎干细胞无血清无饲养层的培养体系。方法将干细胞分别置于Knockout培养基(第1组)、自制无血清培养基(第2组)和添加bFGF及肝素的改良无血清培养基(第3组)中培养25代后观察比较3组干细胞形态学变化、克隆数目及大小。并借助细胞免疫组化、流式细胞术和体外拟胚体形成等方法检测干细胞的未分化状态和全能性。结果传代25次后,第2组克隆逐渐分化。第1组和第3组的干细胞均呈典型的人胚胎干细胞形态特征;细胞表达Nanog,Oct-4,Tra-1-60,SSEA-4,但不表达SSEA-1;流式检测也显示SSEA-4高表达,SSEA-1低表达;体外分化能形成拟胚体。通过单位视野下克隆个数及大小的比较,结果显示第2组与第1组和第3组间的差异显著。结论本研究通过改良本实验室已获得国家专利的无血清培养基,初步建立了人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系,培养效果与公认培养体系无明显差异。

无饲养层条件原代培养小鼠胚胎干细胞的实验研究

目的:对无饲养层条件下原代分离培养小鼠胚胎干细胞(ESC)的可行性进行研究。方法:利用微滴培养技术,将小鼠胚泡分别置于无饲养层条件及人胚胎成纤维细胞(HEF)饲养层上进行培养。观察胚泡的发育行为,并对两种不同条件下ESC的克隆率进行研究。结果:在无饲养层及HEF饲养层条件下小鼠囊胚均可以正常发育,并可以原代培养出ESC克隆,但无饲养层体系的胚泡48 h贴壁率(71.93%)及原代ESC克隆率(5.26%)低于HEF饲养层体系(88.71%,19.35%)(P<0.05)。结论:无饲养层条件下可以成功原代分离培养获得小鼠ESC,但该条件下ESC的分离效率仍需进一步研究。

人诱导性多能干细胞的无饲养层培养及鉴定

目的探索人诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)的无饲养层培养方法,并对此方法培养的i PSCs进行鉴定。方法将人i PSCs接种于玻璃粘连蛋白(Vitronectin XF)包被的培养皿上培养,采用EDTA消化传代。倒置显微镜下观察i PSCs的生长状态;碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定;采用PCR和免疫荧光检测i PSCs多能性基因SSEA-1、Nanog、Sox2的表达情况。结果倒置显微镜下可见i PSCs呈典型的克隆状生长,克隆呈圆形或椭圆形,边界清晰、整齐;ALP染色结果阳性;PCR结果显示人i PSCs强表达多能性基因SSEA-1、Nanog、Sox2;免疫荧光结果显示多能干细胞特异性指标SSEA-1、Nanog、Sox2均呈阳性。结论无饲养层培养体系培养人i PSCs,细胞能稳定增殖,保持自我更新潜能及多能性。

成纤维细胞生长因子支持人胚胎干细胞在无饲养层中的生长(英文)

背景:人胚胎干细胞是一种全能型细胞,可以分化为3个胚层的组织,目前国内对其无饲养层生长的研究较少。成纤维细胞生长因子是维持胚胎干细胞不分化状态的重要因子。目的:探讨长期培养过程中不同质量浓度成纤维细胞生长因子对人胚胎干细胞未分化状态和全能性维持的影响。方法:两株人胚胎干细胞在鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中培养3代,分别转移到含100,160,250μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中培养8代。从培养皿中移出胚胎干细胞,用IV胶原酶消化聚集成团的细胞,观察细胞分化状态和全能性情况。收集传8代后的胚胎干细胞,种植于SCID小鼠体内。对所得细胞做形态学评估,并进行碱性磷酸酶染色、表面标记免疫组化检测、RT-PCR检测OCT-4的表达、体内致瘤情况。结果与结论:在含160,250μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中,两株人胚胎干细胞可以保持原有性状,即细胞克隆呈圆形,核质比较高,中间大片区域为未分化细胞,周围为分化细胞;呈碱性磷酸酶强阳性表达;表达OCT-4转录因子蛋白;细胞表面标志SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81均呈阳性表达;聚集成团的胚胎干细胞培养10d后形成拟胚体;种植于SCID小鼠体内可得含3个胚层组织的畸胎瘤。含100μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基不足以维持人胚胎干细胞的长期增殖,4代以后大部分细胞分化死亡。提示成纤维细胞生长因子质量浓度达160μg/L以上时,可以单独支持人胚胎干细胞的体外稳定增殖,且不影响细胞分化状态和全能性。

人胚胎干细胞无饲养层培养体系的研究进展

人胚胎干细胞具有重要的基础研究价值和巨大的临床应用前景。建立一个理想的人胚胎干细胞培养体系是利用它的前提,但传统的饲养层培养体系中的动物源性物质和大量的未知成分影响了研究人员对人胚胎干细胞培养体系的研究,所以建立一个人胚胎干细胞无饲养层培养体系是非常有必要的。本文主要从细胞外基质、条件培养基、无血清培养基和成分确定的培养基等方面对人胚胎干细胞无饲养层培养体系的研究进展进行综述。

人孤雌胚胎干细胞无饲养层培养体系的建立

目的建立一种安全、有效、经济且适于人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stemcells,hPESCs)体外培养的无饲养层培养体系。方法将常规体外培养的hPESCs分别以mTeSRTMl培养基(对照组)和人包皮成纤维细胞的条件培养基(human foreskin fibroblasts-conditional medium,hFFs-CM)(实验组)扩增培养,倒置显微镜下观察两组无饲养层培养体系下hPESCs的生长状态;采用ALP检测和核型分析研究hPESCs生物学特性;采用RT-PCR检测hPESCs全能性标记物Oct-4的表达情况;通过体外和体内分化实验观察hPESCs向3个胚层分化的潜能。结果两组hPESCs形态规则、不易分化,在形态、扩增速度等方面无明显差异;已成功在体外培养15代,两组均能保持正常女性的二倍体核型46,XX和全能性;RT-PCR检测示两组Oct-4 mRNA均呈阳性表达;体外分化均可形成拟胚体;在裸鼠体内均可形成含有3个胚层组织成分的畸胎瘤。结论 hFFs-CM无饲养层培养体系可长期支持hPESCs的生长并维持其未分化状态,成功建立了一种不仅能维持hPESCs的有效扩增、减少动物源性污染、降低培养成本,还可满足临床大规模应用的hPESCs无饲养层培养体系。

鸡胚胎干细胞无饲养层培养体系的建立及其转染体系的优化

鸡胚胎干细胞(cES)以其全能性,在研究胚胎发育生物学和家禽育种等方面有巨大的应用前景。本实验旨在建立cES无饲养层培养体系和对LipofactiminTMLTX(脂质体)介导转染体系进行优化。采用药匙法从新鲜受精蛋中分离获取cES,接种于层粘连蛋白包被的培养皿,待形成大克隆后,用口吸管剥离法吸取cES克隆进行消化传代,并采用生化和免疫学方法鉴定其干细胞活性。设计质粒量800、900、1 000 ng 3个水平,质粒、脂质体比为1∶1.5、1∶2、1∶2.5体系转染cES。结果表明:无饲养层培养体系体外培养cES细胞能稳定传代至第6代,鉴定结果显示碱性磷酸酶阳性和阶段特异性胚胎抗原1阳性,指明克隆能保持未分化状态;质粒900 ng、质脂比为1∶2时,可获得最佳转染效率72%,为cES的脂质体介导外源基因的转染提供参考。

两株人胚胎干细胞的无饲养层扩增

目的:建立两株中国人胚胎干细胞(hESCs)的无饲养层的培养体系,观察条件培养基所需的饲养层密度,并探索最佳的传代方式。方法:两株人胚胎干细胞hES-846XX和hES-1846XY分别使用不同密度(3×105/mL、6×105/mL和1.2×106/mL)获得的条件培养基(CM)在无饲养层培养体系培养12代以上,用机械分离法和Ⅳ型胶原酶法进行传代,观察比较结果并对所得hESCs鉴定。结果:6×105/mL～1.2×106/mL之间的密度都是合适密度;Ⅳ型胶原酶在长期传代中优于机械法传代;所得细胞维持干细胞未分化状态和全能性。结论:无饲养层的培养体系可以用于中国胚胎干细胞培养,两株中国人胚胎干细胞(hESCs)的倍增周期、所需饲养层密度及分化率等方面与国外hESCs有明显差别。

无饲养层和动物源蛋白的β-地中海贫血诱导多能干细胞系的建立

β-地中海贫血患者因无合适的造血干细胞供体来源从而不得不靠输血维持生命。诱导多能干细胞(iPS)技术为获得患者自身遗传背景的干细胞进行临床治疗开拓了新途径。目前,建立iPS细胞系的过程需要使用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层和动物源的蛋白成分,因此建立的iPS细胞系存在病原体和动物源蛋白污染的可能性,不能应用于临床。采用目前商品化的TeSRTM2和StemAdhereTMDefined Matrix限定培养体系,利用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4个转录因子组装在同一表达载体的可切除的慢病毒感染人β-地中海贫血成纤维细胞,建立了5株无饲养层和动物源蛋白的β-地中海贫血iPS细胞系,这些iPS细胞系具有人胚胎干细胞典型的特征,表达人胚胎干细胞的多能性分子标记,如Oct4、Nanog、Tra-1-60等。在体外分化能够形成拟胚体,在体内分化能够形成含有3个胚层类型细胞的畸胎瘤。

人胚胎干细胞在3种培养体系中的生长

人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)的培养一直是干细胞研究的重要内容.用本实验室独立建系的两株hESCs,建立3种不同的培养体系:小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)做饲养层,永生化人成纤维细胞(immortalized human adult fibroblasts,HAFi)做饲养层,无饲养层条件培养基培养体系(condition medium,CM),观察在3种培养体系中,干细胞的增殖和分化情况.发现3种培养体系中的hESCs都可以表达一致的生物学特性,但也有不同之处,相对于CM干细胞在MEFs和HAFi饲养层体系的分化率低,增殖快;但MEFs来源于鼠类是异源细胞,HAFi虽不含鼠源性成分却繁殖很慢;无饲养层的体系便于操作,无外源细胞存在.实验所得出的结果可以引导研究人员针对于临床、科研不同的需要,选择最适合的培养体系.

诱导人胚胎干细胞向子宫内膜样细胞分化的初步研究

目的:探讨无饲养层培养的人胚胎干细胞诱导分化为子宫内膜样细胞的方法。方法:将无饲养层培养的人胚胎干细胞分别通过共培养诱导法和细胞因子诱导法向子宫内膜样细胞诱导,流式细胞术检测分化的细胞中子宫内膜上皮细胞标志物细胞角蛋白18和间质细胞标志物波形蛋白的表达情况。结果:共培养诱导法和细胞因子诱导法在分化第7天均出现长梭状细胞样改变。分化第8天通过流式细胞术检测发现细胞波形蛋白表达均为阴性,部分细胞角蛋白18表达阳性,共培养诱导法分化率高于细胞因子诱导法[(55.63±10.29)%vs.(13.90±0.26)%,P<0.05]。结论:共培养诱导法和细胞因子诱导法均可使人胚胎干细胞分化为子宫内膜上皮样细胞,但前者的分化效率更高。

明胶铺底培养人胚胎干细胞的初步研究

基质胶是人胚胎干细胞的无饲养层培养体系中常规使用的包被材料,但其价格昂贵同时不方便使用.本文研究了明胶作为替代包被材料的可能性.结果表明,明胶能够维持经胰蛋白酶消化的人胚胎干细胞的未分化状态.生长在明胶上的胚胎干细胞表达多能性标志物,具有畸胎瘤形成能力同时维持正常核型.对在明胶上培养了10代的人胚胎干细胞进行检测,结果显示这些细胞仍然表达高水平的Oct4.同时,与基质胶上生长的人胚胎干细胞相比,明胶上生长的人胚胎干细胞能够形成相似大小和数量的碱性磷酸酶阳性集落(P>0.05),同时生长在两种包被材料上的人胚胎干细胞含有相似比例的SSEA-4阳性细胞(95.1%vs94.3%.P>0.05).

单细胞因子支持人胚胎干细胞生长的培养体系

[目的]为2株中国人胚胎干细胞系建立培养液中仅添加1种细胞因子的培养体系。[方法]两株人胚胎干细胞h ES-846XX和h ES-18 46XY分别使用含有成纤维细胞生长因子(b FGF)160ng/ml、转化生长因子(TGFβ1)20ng/ml和noggin 200ng/ml的培养液进行无饲养层培养,观察细胞的生长情况并对所得细胞进行鉴定。[结果]培养液中添加b FGF 160ng/ml可以有效地支持人胚胎干细胞的长期增殖,传代8次的细胞仍然保持胚胎干细胞的特性。添加TGFβ1或noggin的培养基无法维持人胚胎干细胞的长期增殖,3代以后细胞完全分化。[结论]证明培养液单独添加高浓度b FGF 160ng/ml支持2株中国人胚胎干细胞长期保持未分化状态增殖,实际未分化率为68.2±1.08%。