抗日本乙型脑炎病毒的线粒体靶向小分子化合物的筛选及鉴定

[目的]线粒体作为重要的能量代谢细胞器,不仅可以调控宿主先天免疫通路影响病毒复制,而且其生物学功能的改变与病毒生命周期密不可分。本文旨在确定抑制日本乙型脑炎病毒(JEV)的线粒体靶向化合物。[方法]通过体外CCK-8、间接免疫荧光、蛋白免疫印迹、RT-qPCR以及细胞因子检测等试验,对382种线粒体靶向化合物抗JEV的效果进行评价,筛选到的敏感药物在小鼠体内进行抗病毒效果验证。[结果]通过药物初筛,从382种药物中筛选出9种疑似抗JEV药物,进一步的体外分子试验筛选确定了其中3种药物对JEV复制有明显的抑制作用,分别为丙酮酸钠(sodium 2-oxopropanoate)、布喹那(brequinar)及松果菊苷(echinacoside)。动物试验结果表明,3种药物有效抑制了JEV在小鼠体内的增殖,给药组小鼠体重增加明显高于对照组,血液中的病毒含量更低,死亡率更低,细胞因子水平出现显著变化,其中以布喹那给药组最为明显。[结论]成功筛选出3种抗JEV的线粒体靶向化合物,为探究线粒体在病毒复制中发挥的作用提供了借鉴,也为抗JEV的临床药物研发提供了新思路。

褐藻多糖硫酸脂对小鼠免疫及抗日本乙型脑炎病毒的影响

为了研究褐藻多糖硫酸脂(fucoidan)对小鼠免疫及抗病毒调节作用,研究采用体内和体外试验研究褐藻多糖硫酸脂的免疫调节及抗日本乙型病毒(JEV)作用。结果表明:褐藻多糖硫酸脂能够促进脾脏淋巴细胞增殖,调节CD_4^+T细胞(CD_3^+ CD_4^+)/CD8T细胞(CD_3^+ CD_8^+)/B细胞(B 220+)亚群。说明褐藻多糖硫酸脂能够上调JEV灭活疫苗的抗体水平,同时促进Th1细胞因子IFN-γ及Th2细胞因子IL-4的表达。进一步研究发现褐藻多糖硫酸脂能够直接抑制JEV的复制。说明褐藻多糖硫酸脂具有潜在的抗病毒及免疫调节作用,可作为免疫增强剂及抗日本乙型脑炎的新型药物。

日本乙型脑炎病毒的分离与鉴定

收集一例疑为乙型脑炎病毒感染的种公猪肿大的睾丸病料,并将其处理制成匀浆过滤后,用乳鼠脑内接毒和细胞接毒相结合的方法盲传并分离病毒,然后设计一对PrM/E基因的特异性引物,采用RT-PCR方法对所分离的病毒进行鉴定,并将其PrM/E基因扩增产物测序,测序结果与乙型脑炎GenBank登陆的SA14-14-2株(AF315119)和SA14株(U14163)进行比较。结果表明,所分离病毒的PrM/E基因序列与JEV强毒株SA14和弱毒株SA14-14-2相应序列同源性分别为98.1%和97.1%,证实分离毒株为乙型脑炎病毒。

日本乙型脑炎病毒强、弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-NS2A诱导小鼠CD4^+T细胞应答的研究

为了解日本乙型脑炎病毒(JEV)强、弱毒株非结构蛋白的免疫效果,笔者分析了JEV强、弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A真核表达的差异。通过观察JE减毒活疫苗(SA14-14-2株)和JEV贵州分离株(GZ株)分别在BHK-21细胞上出现的CPE,并收集强、弱毒株的细胞悬液,提取总RNA,分别设计6对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A的编码基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-NS1r、pcDNA3.1(+)-NS2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1q、pcDNA3.1(+)-NS2Aq和pcDNA3.1(+)-NS1-2Aq,将构建成功的6种真核表达质粒免疫健康小鼠,最后采集小鼠的血液和组织分别进行JEV抗体检测和细胞免疫水平检测。研究结果显示:JEV GZ强毒株与JEV SA14-14-2弱毒株能在BHK21细胞上增殖并产生CPE现象;构建的6种真核表达质粒免疫小鼠后经血常规和T淋巴亚群检测可以极显著或显著增加CD4+和CD8+细胞的含量。表明JEV强毒株非结构蛋白所诱导的细胞免疫略优于弱毒株非结构蛋白诱导的细胞免疫,但差异不明显。本研究结果可为日本乙型脑炎病毒的病原基础研究提供参考。

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选

为筛选日本乙型脑炎病毒(JEV)的E抗原表位,本实验以抗JEV E蛋白的单克隆抗体(MAb)作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体七肽库,挑取噬菌体单克隆培养并采用MAb包被的ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEV E抗原模拟表位的氨基酸序列。设计合成包含该表位的E抗原15肽(E-365GGADSMSMAGMAVSYE-379)cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达质粒,诱导表达重组多肽并进行western blot验证。经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆采用MAb包被进行ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性。对重组多肽进行western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多克隆抗体。本实验成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为开展用JEV抗原表位探索JEV的防制研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要依据。

日本乙型脑炎病毒贵州分离株NS1基因克隆及表达载体的构建

为了研究日本乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因工程疫苗、生物免疫活性及细胞因子IL-2对真核表达的影响,试验采用RT-PCR方法扩增出JEV贵州分离株(GZ株)NS1 cDNA,克隆到pMD19-T载体上,再进行双酶切并回收目的片段,分别与pET32a(+)和pcDNA3.1(+)载体连接并转化入感受态细胞Top10中,构建原核表达载体pET32a(+)-NS1和真核表达载体pcDNA3.1(+)-NS1,并将NS1基因插入已经构建好的重组质粒pcDNA3.1(+)-IL-2上,构建以IL-2融合表达的真核载体pcDNA3.1(+)-IL-2-NS1,分别通过抽提阳性质粒酶切鉴定和测序后,应用DNAStar等生物软件进行序列分析,最后进行原核表达载体和真核表达载体双酶切及测序。结果表明:JEV GZ株NS1 cDNA全长为1 245 bp,可编码415个氨基酸。说明JEV GZ株NS1 cDNA克隆成功,JEV GZ株NS1基因的原核表达载体、真核表达载体以及IL-2融合表达的真核载体构建成功。

猪日本乙型脑炎病毒NS1基因重组腺病毒的构建及表达

应用RT-PCR方法扩增出猪日本乙型脑炎病毒(JEV)的NS1基因,通过SalⅠ+EcoRⅠ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR鉴定及间接ELISA检测的结果证明所构建的重组腺病毒成功地表达了JEV的NS1。

日本乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1-Flag蛋白在293T细胞中的表达

通过RT-PCR方法扩增出日本乙型脑炎病毒SA14-14-2株的NS1基因,利用HindⅢ和HpaⅠ双酶切克隆到带有Flag标签的pcDNA3.1载体上,重组质粒命名为pcDNA3.1-NS1-Flag。脂质体法转染293T细胞后,经间接免疫荧光(IFA)和化学荧光Western blotting检测,证明带有Flag标签的NS1基因在293T细胞中得到高效表达。

重组日本乙型脑炎病毒NS1的可溶性表达及抗原性分析

根据日本乙型脑炎病毒(JEV)Whe株非结构蛋白质1(NS1)的基因序列,设计引物,利用反转录PCR从实验室保藏JEV Whe株中克隆NS1全长序列,并将其插入pET28a表达载体,构建重组表达质粒NS1-pET28a,转化大肠杆菌BL21(ED3),经IPTG诱导,得到可溶性表达的融合蛋白质His-NS1。结果表明,该融合蛋白质分子量为46ku,大量表达于上清中。镍离子亲和层析柱进行纯化得到His-NS1蛋白质,经Western-blot检测,证明其具有良好的免疫学活性,这为进一步研究JEV NS1的功能及应用奠定了基础。

单克隆抗体治疗日本乙型脑炎病毒感染恒河猴的实验研究

恒河猴感染日本乙型脑炎病毒(JEV)后,出现脑炎的一系列症状与体征,终因呼吸及循环衰竭而死亡。病毒感染猴体温升至39℃以上后的第2天,注射单克隆抗体(McAb)制剂进行治疗。结果McAb经肌肉、静脉、硬膜下加肌肉等不同途径注射后,均显示良好的疗效,对恒河猴的保护率达100％;其中以硬膜下加肌肉途径注射McAb的效果最佳。多次注射McAb,未发现任何不良反应与毒副作用;提示将鼠源性McAb用于灵长类安全可靠,若过渡到临床使用,是可行的。

日本乙型脑炎病毒NS1基因及其疫苗的研究进展

日本乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的严重的人畜共患传染病。乙型脑炎病毒的三种糖基化蛋白PrM、E和NS1是其主要免疫保护性抗原,其中PrM和E蛋白是日本乙型脑炎病毒的结构蛋白,其结构和相关疫苗研究的报道较多。NS1蛋白是日本乙型脑炎病毒的非结构蛋白,其主要参与病毒复制的早期阶段,推测可能参与病毒组装和释放。可诱导补体依赖性溶细胞反应,不能产生中和抗体,能诱发机体在非中和性抗体存在的情况下产生保护性免疫。在接种乙脑病毒的细胞的细胞内、细胞表面及上清液中均含有大量的NS1蛋白。对小鼠接种NS1蛋白或NS1蛋白特异性抗体,均能让小鼠产生对乙脑病毒感染的保护性免疫作用。本文主要就乙型脑炎病毒非结构基因NS1及其免疫疫苗的研究进展进行综述,为其更进一步深入研究JEVNS1基因及其相关疫苗奠定基础。

日本乙型脑炎LAMP方法的建立和应用

日本乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE,简称乙脑）是一种由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的人畜共患的病毒性疾病。对于人类和动物的健康有极大的威胁,主要引起人的神经性疾病以及猪的繁殖障碍。

日本乙型脑炎病毒小鼠脑内分布研究

为定位检测日本乙型脑炎病毒(JEV)在试验小鼠脑内分布情况,本研究建立了JEV的小鼠感染模型,取发病死亡小鼠的脑组织制作石蜡切片,利用抗JEV单克隆抗体,采用免疫酶组化方法对抗原进行组织学定位检测。试验结果表明,所建立的间接免疫酶组化方法灵敏度高,特异性好,证明了JEV选择性感染神经元,抗原阳性表达主要集中在脑干、神经节及大脑皮质。

日本乙型脑炎病毒NS5rdrp蛋白的真核表达及鉴定

为了探究日本乙型脑炎病毒( Japanese encephalitis virus,JEV)的复制机理和研制以 JEV 复制复合体为靶标的药物,试验以 GenBank 中收录的 JEV HW1 株基因序列为模板,设计针对 NS5rdrp 的特异性引物,提取 JEV RNA,反转录得到 cDNA,以其为模板使用 PCR方法克隆得到 NS5rdrp 基因片段;利用 T4DNA 连接酶构建重组质粒 pcDNA3. 1-NS5rdrp,并对产物测序;提取去除内毒素的重组质粒,用转染试剂 X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 转染 BHK21 细胞,转染 24 h 后观察结果;最后利用 Western-blot 技术检测 NS5rarp 蛋白的表达情况。结果表明: PCR扩增得到大小约为920 bp的 NS5rdrp 基因片段;测序结果经 NCBI 上 BLAST 比对分析,克隆得到的 NS5rdrp 基因与 HW1 株的同源性为 100%;转染时细胞的最佳密度区间为 70%~ 80%,转染试剂与转染质粒的比例为 3 ∶ 1;经过Western-blot 检测,重组质粒在细胞内正常表达,NS5rdrp 蛋白的分子质量约为 37 ku。说明试验通过真核表达成功获得 NS5rdrp 蛋白。

药师参与日本乙型脑炎合并肺部感染治疗实践1例

目的:通过临床药师参与1例日本乙型脑炎合并肺部感染患者的治疗实践,探讨药师在临床发挥的作用。方法:临床药师积极参与该患者的整个治疗过程,围绕抗病毒、抗癫痫、抗感染等方面开展药学监护,对治疗药物的选择、剂量、疗程提出合理化建议,关注药物相互作用及不良反应。结果:患者治疗过程顺利,病情逐步得到控制,整个治疗过程中未见明显药品不良反应。结论:临床药师参与疾病治疗工作,旨在优化治疗方案,确保患者用药安全、有效。

甘肃省景泰县日本乙型脑炎发病情况调查和分析

甘肃省景泰县日本乙型脑炎发病情况调查和分析高鹏程苏进才张承芸郝社平孙国栋（甘肃省景泰县畜牧兽医技术服务中心７３０４００）日本乙型脑火是一种人畜共患传染病，在马属动物表现为中枢神经系统高度兴奋或沉郁、麻痹。景泰县自７０年代以来每年都有马类家畜发病。本病...

云南省洱源县日本乙型脑炎流行病学监测及病毒分离鉴定

日本乙型脑炎作为一种自然疫源性疾病,在人、畜、媒介昆虫中间循环,一旦条件适宜即可酿成爆发流行。为了掌握乙脑流行的一般规律及其流行特征,必须对调查区域外环境、人群、家畜、媒介进行系统监测。1986年5月-1988年2月我们对乙脑高发流行区的洱源县右所区进行了蚊种种群组成、季节消长、成蚊自然带毒率、媒蚊密度与乙脑流行的关系。

日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因表达的研究

日本乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的严重的人畜共患性传染病,日本乙型脑炎病毒的结构蛋白包括C、Pr M和E 3种。其中C蛋白主要参与病毒RNA和蛋白之间的相互作用,且具有核定位信号序列,在乙脑病毒中,缺失此序列后C蛋白只在感染细胞的细胞质中出现;PrM和E基因是其主要免疫保护性抗原基因,表达的蛋白是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白,是病毒颗粒的主要成分,也是维持病毒粒子形态结构的主要物质,主要参与病毒感染的后期阶段,可诱导产生保护性免疫。近年来许多学者对日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因原核表达和真核表达及其相关免疫原性进行了大量的研究,取得了一定的研究进展,文章主要针对日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因表达的研究进展进行了综述,为乙型脑炎基因工程疫苗的进一步研究提供参考。