日本结缕草ZjTCP20基因生物信息学及表达模式分析

TCP是高等植物所特有的一类转录因子,参与调控植物的生长发育、衰老及逆境应答等多个生物学过程。本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆出ZjTCP20基因,并对该基因进行生物信息学分析、自激活检测、表达模式分析等来探究该基因特性。ZjTCP20基因完整编码区为624 bp,编码208个氨基酸。ZjTCP20蛋白无信号肽,具有疏水性,系统发育进化树结果显示其与玉米(Zea mays)ZmTCP20亲缘关系最近。亚细胞定位显示该蛋白定位于叶绿体、细胞质和细胞核上。ZjTCP20基因表达模式结果显示,该基因在幼嫩叶片中大量表达,随植物发育表达量逐渐减少,但茉莉酸甲酯(MeJA)等3个激素对基因的表达量没有显著影响。酵母自激活试验显示ZjTCP20具备自激活活性。本研究为进一步研究ZjTCP20基因提供了科学依据。

日本结缕草(Zoysia japonica)酵母杂交cDNA文库的构建及分析

酵母双杂交和单杂交技术是生物大分子互作和调控研究中的高效分子生物学技术,是蛋白质互作或蛋白质与DNA互作筛选的手段。本研究旨在构建高容量的日本结缕草(Zoysia japonica)酵母文库,以便后续深入挖掘日本结缕草相关基因,进行基因功能及基因网络研究。本研究应用不同组织来源以及不同生长时期的日本结缕草,通过SMART技术构建了高容量的酵母杂交cDNA文库。质量检测结果显示:次级文库库容为4.0×10^(6)cfu·mL^(-1),总克隆数为1.6×10^(7),重组率>95%。最终获得的Y187酵母文库工作液细胞密度为3×10^(7)cells·mL^(-1),插入片段具有良好的多态性。以日本结缕草类胡萝卜素裂解双加氧酶ZjCCD7作为诱饵,从构建的酵母文库中筛选到一个与ZjCCD7互作的蛋白ZjatpG,证明该文库质量较高,符合酵母杂交筛选试验标准,可适用于调控和互作蛋白筛选。本研究为筛选日本结缕草的互作蛋白以及基因功能研究提供了基础。

以基因枪法转化日本结缕草获得转基因植株

将含有DREB1A和gus基因的双基因载体质粒包裹在金粉上,以基因枪轰击日本结缕草胚性愈伤组织,以gus基因的瞬时表达研究日本结缕草基因枪转化参数.结果表明,在1 100 psi压力下6 cm的轰击距离、每皿轰击2次的转化效果最好,而金粉和质粒用量对转化效率影响不显著;经过筛选和再生培养,检测到gus基因的稳定表达,并获得日本结缕草潮霉素抗性株系,PCR-Southern杂交证实外源DREB1A基因已整合到日本结缕草基因组中.

^(60)Co-γ射线对日本结缕草干种子的辐射效应研究

用不同剂量(200~500 Gy)的60Co-γ射线辐射日本结缕草Zoysia japonica干种子,通过对辐射后干种子的发芽和幼苗生长情况进行了室内外观测,结果表明:低剂量辐射处理促进日本结缕草干种子的萌发,提高其发芽率,随着辐射剂量的增加,发芽率逐渐降低,临界辐射剂量(剂量率为1.0 Gy/min)为450 Gy;田间出苗率临界辐射为250 Gy,低于临界辐射剂量时,随辐射剂量的增大,田间出苗率增加,高于临界辐射剂量时,随辐射剂量增大,田间出苗率降低;不同的剂量处理,干种子发芽后根系和幼苗的生长差异显著(P<0.05),在主根长度、幼苗高度和幼苗鲜质量方面表现为先促进后抑制,临界辐射剂量分别为400、300和250Gy;根据辐射剂量与相对出苗率的关系折线图可以初步确定,日本结缕草干种子辐射育种的半致死剂量为480 Gy。

日本结缕草ZjADH基因的克隆及表达分析

采用RACE技术从日本结缕草中克隆出1个乙醇脱氢酶基因,命名为ZjADH(GenBank登录号为KT596065)。ZjADH与甘蔗、美洲蒺藜草和沟叶结缕草等ADH基因同源性均在90%以上,进化分析表明其与沟叶结缕草亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,ZjADH定位于细胞质。实时荧光定量分析结果表明,ZjADH在日本结缕草根中表达量最高,ZjADH可响应ABA、MeJA和SA的诱导,在低温、干旱和高盐胁迫中发挥重要作用。

日本结缕草抗寒相关性状的QTL分析

为寻找与结缕草（Zoysia japonica steud.）抗寒性状相关的数量性状位点（QTLs）,利用生态条件具明显差异的2个日本结缕草品系室兰（Zoysia japonsic cv. Muroran）和俵山北（Zoysia japonsic cv. Tawarayama Kita）及其假测交产生的F1代86个个体为材料,研究其在人工低温胁迫条件下叶片的半致死温度（LT50）及可溶性糖、可溶性蛋白含量及过氧化物歧化酶（SOD）活性的变化,并以447个SSR标记构建的日本结缕草遗传连锁图谱为基础,对抗寒相关的性状可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD活性进行了QTL定位分析。结果表明：F1群体的可溶性蛋白含量与叶片LT50呈显著负相关（P〈0.05）,可溶性糖含量及SOD活性与叶片LT50呈极显著负相关（P〈0.01）。分别定位到与叶片可溶性糖、可溶性蛋白含量和SOD活性相关的QTL各1个,分布于3个连锁群上,QTL的LOD值介于2.19~2.42之间,单个QTL可解释性状表型变异的范围在13.3%~13.8%。

日本结缕草植株再生体系的研究

以日本结缕草的成熟胚为外植体,对其组织培养体系进行了优化.试验结果表明,1)培养基中添加脯氨酸能提高愈伤组织诱导率,而添加BA能降低愈伤组织的诱导率,低浓度的NAA(0.1～0.2 mg/L)能促进愈伤组织的形成,愈伤组织诱导的最佳培养基为ND+2,4-D 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+L-Pro 500 mg/L,愈伤组织诱导率达57.3%;2)愈伤组织继代的最佳培养基为MSD+2,4-D 1.0 mg/L;3)愈伤组织分化的最佳培养基为MSD+NAA 0.3 mg/L+KT 0.5 mg/L+BA 0.05 mg/L,分化率达36.7%.

日本结缕草成熟种子愈伤组织诱导及植株再生的影响因子分析

【目的】优化日本结缕草的组织培养体系,提高其植株再生率,建立高频植株再生体系。【方法】以日本结缕草的成熟种子为外植体,分析激素、基本培养基、培养条件、脯氨酸、Cu2+等因子对愈伤组织诱导及植株再生的影响。【结果】(1)培养基中添加脯氨酸能提高愈伤组织诱导率,而BA降低愈伤组织的诱导率,低浓度的NAA(0.1～0.2mg·L-1)能促进愈伤组织的形成,愈伤组织诱导的最佳培养基为ND+2,4-D3.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+L-Pro500mg·L-1,愈伤组织诱导率达57.3%;(2)愈伤组织继代的最佳培养基为MSD+2,4-D1.0mg·L-1;(3)愈伤组织分化的最佳培养基为MSD+NAA0.3mg·L-1+KT0.5mg·L-1+BA0.05mg·L-1+L-Pro500mg·L-1,分化率达36.7%。【结论】优化了日本结缕草的组织培养体系,初步找到了影响其成熟种子愈伤组织诱导及植株再生的主要因子。

日本结缕草愈伤组织的诱导和植株再生

以日本结缕草Zoysia japonica Steud的成熟种子为外植体进行了胚性愈伤的诱导与植株再生,结果表明:种子经去皮预处理后,含2.0 mg/L 2,4-D的MS基本培养基能成功诱导去皮种子产生愈伤组织,愈伤组织诱导率高达87.1%。愈伤组织在继代过程中共产生4种不同的类型。1/2 MS中添加0.4 mg/L KT或添加1.0 mg/L KT和1.0 mg/L NAA均能有效促进胚性愈伤的分化,分化率分别为63.8%、66.0%。

日本结缕草离体培养及高频率植株的再生

以日本结缕草(Zoysia japonica)叶片作为外植体进行离体再生研究。结果表明:叶片愈伤组织诱导的最佳培养基是MS+1.5mg.L-12,4-D+0.5mg.L-16-BA+26g.L-1蔗糖+5.0g.L-1琼脂,诱导率为65.36%,无性世代增殖倍数高达9.56;正交试验和方差分析筛选出不定芽分化的最佳培养基为MS+3.0mg.L-1BAP+0.5mg.L-1NAA+1.5mg.L-1AgNO3+35g.L-1蔗糖+6.5g.L-1琼脂,分化率为67.30%,增殖系数为8.67;生根培养基选用1/4MS+0.2mg.L-1IBA+0.3mg.L-1NAA+28g.L-1蔗糖+4.5g.L-1琼脂,生根率为89.60%。

日本结缕草总RNA提取和mRNA分离方法的优化

介绍了分别以日本结缕草根部、叶部、匍匐茎等为材料的总RNA提取的改良步骤,质量和浓度检测及其注意事项,并采用Promega公司的Poly ATract Systems Ⅲ(Z5300)试剂盒进行mRNA分离,尽管这一方法成熟可行,但仍存在洗脱体积较大,常需先沉淀浓缩后才能进行后续试验(如cDNA合成),在制备少量mRNA时回收率较低等问题。据此,对mRNA分离方法作了改良,介绍了mRNA分离的优化步骤,通过增加体系形成了一种更适合于日本结缕草mRNA分离的方法,从而为日本结缕草的分子生物学研究提供基础资料。结果证明所提取的总RNA和mRNA完整,质量较高,并应用到日本结缕草cD-NA文库的构建。

日本结缕草转基因技术研究进展

对日本结缕草离体植株再生及遗传转化研究进展进行了详细的综述,并简要讨论了应用转基因技术培育日本结缕草新品种的育种方向。

日本结缕草茎节和愈伤组织再生体系的优化

分别以日本结缕草的成熟胚和茎节为外植体,建立并优化了2套组培再生体系.实验结果表明：利用成熟胚诱导愈伤组织,适宜诱导培养基为MS基本培养基添加2 mg/L 2,4-D配合0.2 mg/L 6-BA,诱导率为42.5%;继代培养可改善愈伤组织状态,增加胚性,其中增加培养基渗透压,并适当添加ABA（0.2 mg/L）,可明显提高胚性愈伤组织比率;继代2次后的愈伤组织在3种细胞分裂素6-BA,KT,ZT适当配比的分化培养基上,分化率可达到50%~75%.在以茎节为外植体的组培体系中消毒处理和预培养是比较关键的环节;预培养时MS培养基效果优于1/2 MS,在MS基本培养基中添加0.25 mg/L KT,1.0 mg/L ZT和0.1 mg/L NAA为比较适合的芽诱导培养基,诱导率可达37.9%.同时,比较了两套再生体系的优缺点,为日后日本结缕草的遗传转化奠定基础.

影响日本结缕草成熟种子愈伤组织诱导率和出愈时间的相关因子研究

诱导率和出愈时间是愈伤组织诱导过程中的关键参数。本研究以日本结缕草(Zoysia japonica)成熟种子为材料,研究了研磨、接种方式和浸泡等因素对愈伤组织诱导率和出愈时间的影响。结果显示,在MS+2,4-D 5 mg/L+L-Pro 500 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L培养基上,pH5.8时,研磨处理的结缕草种子愈伤组织诱导率远高于未研磨处理的;随机接种方式的愈伤组织诱导率高于机械接种方式的;浸泡72h后愈伤组织诱导率高。结果表明,在研磨情况下,日本结缕草种子浸泡72 h后,采取随机接种方式,培养第5～7 d即出现愈伤组织,第9～11 d愈伤组织发生达到高峰期,第14 d便可进行继代培养,愈伤组织诱导率达95.6%。

几种因素对日本结缕草愈伤组织诱导与生长影响的研究

研究了基本培养基、碳源、营养添加物、pH值、固化剂等几种因素对日本结缕草‘Qingdao’和‘Zenith’两个品种成熟种子为外植体诱导愈伤组织的影响。结果表明:蔗糖作为碳源、pH值5.4～6.0、以植物凝胶或脱乙酰吉兰糖作为固化剂有利于日本结缕草愈伤的诱导与生长,NMB培养基、NB培养基分别有利于Zenith及Qingdao胚性愈伤的形成;而营养添加物的加入虽可提高愈伤诱导率,却导致胚性愈伤率的下降。同时,根据愈伤组织生长曲线得出,愈伤组织最适继代周期为24～33天。

日本结缕草草坪中杂草的发生与防治研究

经１９９５ ～１９９８ 年对日本结缕草草坪中杂草发生规律及其防治体系进行了初步研究，研究结果表明，一年四季草坪中均有杂草发生，但主要以２ ～６ 月和９ ～１２ 月为主，并根据杂草的发生情况，建立了以化学除草为主的防除体系，提出了适宜的除草剂种类、剂量以及用药时间和方式。

日本结缕草滞绿基因ZjSGR对烟草的转化及功能分析

SGR基因是植物体内调控叶绿素降解的关键基因之一,在调控植物衰老以及响应非生物胁迫等方面也发挥着重要的作用。本研究利用DNA重组技术,构建35S::ZjSGR:YFP植物表达载体,并通过农杆菌介导的方法成功转化烟草。PCR和qRT-PCR结果显示日本结缕草滞绿基因ZjSGR已整合到烟草基因组中,并能够在转基因烟草中高效表达。在正常生长环境下,转基因烟草表现出黄化的表型。与对照相比叶绿素含量较低,光合速率下降。亚细胞定位实验证明ZjSGR定位在叶绿体,透射电镜观察结果表明过表达ZjSGR基因使叶绿体发育异常,且有加速降解的趋势。qRT-PCR结果发现转ZjSGR基因的烟草中SAG113,SAG12,NCED和AAO_3的表达量明显高于野生型,衰老进程明显加快。本研究证明ZjSGR可在调控叶绿素降解和衰老的进程中发挥重要作用。

日本结缕草(Zoysia japonica)磷脂酶D基因部分保守序列的克隆及其对机械损伤的响应

以日本结缕草Zenith为材料,通过同源克隆的方法克隆出其磷脂酶D(PLD)基因部分保守序列,序列长399 bp,并通过实时荧光定量PCR检测PLD基因在机械损伤胁迫下随时间变化的表达模式。结果表明,磷脂酶D在胁迫2 h内大量表达,随后逐渐降低,在9 h已接近于对照水平,说明PLD基因在损伤初期大量参与了应对机械损伤胁迫的防御与修复过程,在损伤后期其作用减弱或被代替;电导率的测定结果表明,细胞膜结构在胁迫初期遭到极大程度的破坏,胁迫9 h后膜损伤程度开始减轻。结合PLD基因和电导率的表达模式,推测PLD基因在6 h内会激活一系列感受信号及下游信号分子,9 h后其相应防御机制发挥作用来减轻胁迫造成的损害。

日本结缕草衰老叶片全长cDNA文库构建及酵母单杂交筛选验证

脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(Pheophytin pheophorbide hydrolase,PPH)是叶绿素降解过程中的一个关键酶,目前有关日本结缕草(Zoysia japonica)PPH基因的上游调控机制仍不是十分清楚,筛选日本结缕草ZjPPH1基因上游转录因子可以为延长绿期延缓衰老提供理论依据。本研究利用Clontech的SMRT cDNA合成技术构建一个日本结缕草衰老叶片的高质量全长cDNA文库,其滴度为2.0×106 cfu·mL-1,插入片段平均长度大于1 kb,cDNA片段插入重组率为100%。该文库的完整性较高,可涵盖绝大多数基因信息,为酵母单杂交筛选奠定了基础。利用酵母单杂交技术,筛选到可与ZjPPH1基因启动子片段结合的候选菌落42个,并对20个候选基因进行测序和生物信息学分析,初步筛选到6个参与细胞生长和衰老过程的重要候选基因,为进一步探索ZjPPH1基因在日本结缕草衰老和叶绿素降解中的上游调控机制提供了理论支撑。