日本蛇根草化学成分的提取分离及其抗氧化活性研究

以日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica Bl.)作原料,无水乙醇浸提后利用不同极性有机溶剂萃取,在对不同萃取部位的抗氧化活性初步分析的基础上,通过硅胶及Sephadex LH-20柱层析等色谱分离技术对各萃取部位的化学成分进行分离和纯化。研究结果表明:日本蛇根草的各萃取部位均具有抗氧化活性,其中氯仿萃取部位的活性最高,对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·),以及2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸二胺盐自由基(·ABTS^(+))的清除率分别为86%和89%。从不同萃取部位共分离得到10个化合物,分别鉴定为(E)-3-((9H-吡啶[3,4-b]吲哚-1-基)甲基)-2-亚乙基戊烷-1,5-二醇(1)、 6-羟基哈曼碱(2)、哈曼碱(3)、对羟基苯甲醛(4)、东莨菪素(5)、 3-氧代-α-紫罗兰醇(6)、黑麦草内酯(7)、β-谷甾醇(8)、 3-表-坡模酸(9)和1-油酸甘油酯(10)。其中,化合物1、4、6、7、9和10为首次从蛇根草属中发现。自由基清除实验结果显示:化合物2具有显著的抗氧化活性,对DPPH·和·ABTS^(+)的半数抑制浓度(IC_(50))分别为0.209和0.212 mmol/L。

日本蛇根草OjDFR5基因的克隆与真核表达载体的构建

二氢黄酮醇4-还原酶具有明显的底物特异性,是类黄酮代谢途径中的关键酶,对不同花青素的合成与积累起到决定作用,直接影响植物的颜色性状。日本蛇根草是一种具有较好药用价值的研究材料。通过分子生物学方法克隆获得日本蛇根草中的二氢黄酮醇4-还原酶的编码基因,OjDFR5,并对该基因的序列进行分析,同时将其与真核表达载体pBI121进行连接,获得真核重组表达质粒pBI121-OjDFR5,并将重组质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中。研究结果一方面为该基因的功能解析奠定基础,同时也为探究日本蛇根草类黄酮代谢机制研究提供基因资源。

抗癌药物在日本蛇根草中的检测(英文)

利用HPLC技术在日本蛇根草中检测到了抗癌药物喜树碱(CPT)和羟基喜树碱(HCPT),而这2种药物是当今世界应用比较广泛的抗癌药物.蛇根草是中国传统的中草药,检测到日本蛇根草中含有CPT和HCPT,为获得这2种抗癌药物提供了新的生药途径,同时也为利用基因工程手段提高蛇根草中CPT和HCPT含量奠定了基础.

HPLC法测定日本蛇根草不同组织器官中绿原酸的含量

目的：测定日本蛇根草不同组织器官及发育周期中绿原酸的含量。方法：建立高效液相色谱法。色谱柱ODS Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相乙腈：0.4%磷酸溶液（1∶9）,流速：1.0 ml·min-1,检测波长：327 nm;柱温：30℃。结果：绿原酸在0.022～1.320μg（r=0.999 9）范围内线性关系良好。2月花期采收的日本蛇根草根、茎、叶、花中绿原酸的含量分别为7.076 7,1.030 7,10.609 5,24.110 3 mg·g-1,其全草与四月果期的全草绿原酸含量分别为18.600 4,14.082 6 mg·g-1。结论：日本蛇根草不同组织器官绿原酸含量差异较大,其中花的含量最高。不同发育周期绿原酸的含量也不同,花期含量明显高于果期。

日本蛇根草生物群落种间的联结性

对日本蛇根草群落进行野外调查,运用种间联结指数及2×2列联表的χ2统计量,分别测定了日本蛇根草群落中物种总体关联性和群落中主要植物物种对间的联结性。结果表明,群落物种总体表现出一定程度的正关联,群落处于比较稳定的阶段。群落中13种主要植物物种的78个种对中,有37个种对表现出正关联,有40个种对表现出负关联,一个种对表现为相互独立的关系,正负关联种对比例接近1∶1。而日本蛇根草与其它12个物种之间有8对表现为正联结,有4对表现为负联结,但均未达到显著水平。

日本蛇根草Actin基因片段的克隆及其序列分析

为研究日本蛇根草功能基因的表达提供内参基因,笔者参照GenBank中桔梗的肌动蛋白基因(Actin)序列设计引物,以日本蛇根草的cDNA为模板,通过RT-PCR方法成功克隆获得日本蛇根草Actin基因片段,并将其命名为OjActin(OjActin片段长469 bp)。功能保守域分析显示OjActin归属于Actin超家族,与其他植物Actin的氨基酸序列同源性达94%以上;系统进化树分析显示,OjActin与咖啡的亲缘关系最近。

日本蛇根草的利用价值与繁殖栽培技术

日本蛇根草不仅具有活血、清肺、降血压、抗癌等药用功效,还具有较高的园林观赏价值,是林下地被、室内盆景、植物墙等的优良植物材料,拥有广阔的市场前景,但对生长环境的要求较高,至今未见人工栽培的报道。对其扦插、播种、栽培技术等进行研究,探索出了一套简便实用的繁殖栽培技术方案。

日本蛇根草DFR3基因的克隆分析及其编码蛋白的分离纯化

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)作为花色苷代谢途径下游的关键酶,对植物花色苷的合成具有重要调控作用。该研究以日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)为材料,采用RT-PCR方法克隆获得一个DFR基因(OjDFR3),利用生物信息学方法对OjDFR3蛋白的性质进行了分析,通过实验完成该基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的制备与纯化,为深入揭示日本蛇根草DFR基因的功能以及花色苷的合成与调控研究奠定基础。结果表明:(1)成功克隆获得一个DFR基因(OjDFR3);序列分析显示,OjDFR3基因cDNA全长为1071 bp,可编码356个氨基酸,蛋白分子量为39.52 kD。(2)生物信息学分析表明,OjDFR3基因编码形成的蛋白由20种氨基酸组成,其中亮氨酸含量最多,不存在信号肽,是一种亲水性蛋白,定位在细胞质的可能性最大,三级结构由α螺旋、延伸链、无规则卷曲组成。(3)原核表达分析显示,重组质粒pET32a-OjDFR3可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,其最佳诱导表达条件为37℃、4 h、IPTG浓度为0.8 mmol/L,同时在100和200 mmol/L咪唑洗脱下的蛋白纯度最好。(4)按照上述最佳条件,制备并获得了大量浓度和纯度较好的蛋白。

长柱型日本蛇根草花冠筒内横生绒毛作用探究

目的:日本蛇根草有长柱型和短柱型两种花型,且长柱型花筒内有一圈横生绒毛,而短柱型则无,因此对长柱型日本蛇根草花筒内绒毛结构的作用进行探究。方法:通过热成像仪记录长柱型、短柱型、去除绒毛长柱型花筒区域的温度变化;利用TTC染色法比较长短柱型花粉活力强弱;使用联苯胺-过氧化氢溶液检测长短柱型柱头可授性持续时长;同时将不同柱型同开放时长的花药浸水一定时长后,用TTC染色法对花粉染色,比较不同柱型花粉的耐水性;最后进行自然和自交情况下的授粉处理,收取种子,比较不同柱型的种子数。结果:长柱型日本蛇根草花筒区域温度整体水平上高于短柱型和去除绒毛长柱型;长柱型花粉活力较强,且花粉寿命长于短柱型;长短柱型柱头可授性持续时长均在6天左右,且都在第3天后可授性急剧下降;长柱型花粉耐水性比短柱型强;长柱型自然和自交授粉处理所结种子数均高于短柱型。结论:长柱型的绒毛结构具有保温作用,同时也在其花粉活力和防止自交等方面有一定影响。

日本蛇根草Oj5GT1的克隆与表达分析

类黄酮5-O-糖基转移酶在增加类黄酮水溶性与稳定性方面发挥重要作用。本研究基于转录组测序结果,利用RT-PCR方法从日本蛇根草中克隆获得Oj5GT1基因,对其序列进行生物信息学分析,并通过Real-time PCR分析Oj5GT1在根、茎、叶、花瓣、花葶、萼片及花朵4个不同发育时期的表达情况。结果显示,Oj5GT1开放阅读框长1416 bp,编码471个氨基酸;蛋白理论等电点为5.14,为亲水性蛋白,不含信号肽,具有2个糖基化位点;系统进化分析表明,Oj5GT1与类黄酮5-O糖基转移酶归为一类。表达分析显示,Oj5GT1在日本蛇根草花葶和花瓣的表达量显著高于根和叶,且伴随花朵发育过程表达量呈先降低后升高趋势。本研究为解析Oj5GT1基因的生物学功能及其调控日本蛇根草花色素苷的生物合成研究提供了坚实的理论支撑。

日本蛇根草查尔酮合酶基因的克隆及其生物信息学分析

查尔酮合酶(CHS)是类黄酮生物合成过程中的第一个关键酶,其在类黄酮的合成过程中发挥着非常重要的作用。本研究以日本蛇根草为研究材料,根据其转录组测序结果设计全长引物,通过RT-PCR方法成功克隆得到日本蛇根草查尔酮合酶基因完整的cDNA序列,并利用相关生物信息学软件对其进行分析。结果表明,该基因序列全长为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测其蛋白分子量为42.783 kD,等电点为6.05,是亲水性蛋白质,不含有信号肽,很可能定位在细胞质中。同时,二级结构分析显示,日本蛇根草CHS的二级结构分别由180个α螺旋、84个延伸链、125个无规则卷曲组成,这与三维结构预测结果相一致。日本蛇根草CHS基因的克隆对于研究植物类黄酮的生物合成及其分子机制具有重要意义,同时也丰富了双子叶植物PKS基因家族的相关研究。

日本蛇根草黄酮醇合成酶基因的克隆及其序列分析

黄酮醇合成酶（FLS）是黄酮醇生物合成途径中的重要调控酶,在黄酮醇生物合成过程中发挥着非常重要的作用。为了更好的认识日本蛇根草黄酮醇合成酶基因的结构特征,本研究以日本蛇根草为研究材料,以其转录组测序结果为基础、通过RT-PCR等方法成功克隆得到日本蛇根草FLS基因的完整c DNA序列,并采用生物信息学方法对日本蛇根草的FLS基因序列进行功能结构域、生理和化学参数、亲/疏水性、信号肽、二级结构等预测分析。分析结果表明,该基因序列全长1 008 bp,编码335个氨基酸,预测其蛋白分子量为38.342 k D,等电点为5.87,为亲水性蛋白质,不含有信号肽。

日本蛇根草花青素还原酶基因的克隆及其生物信息学分析

花青素还原酶(anthocyanidin reductase, ANR)是原花青素合成途径中的关键酶,同时花青素还原酶对植物花色苷的积累也发挥着重要作用。本研究以日本蛇根草为材料,以其转录组测序结果为基础,设计引物通过RT-PCR方法成功克隆得到日本蛇根草ANR基因完整的cDNA序列,利用生物信息学方法和工具对日本蛇根草ANR基因的功能结构域、生理和化学参数、亲/疏水性、信号肽、二级结构等进行预测和分析。结果表明,该基因cDNA全长为1 020 bp,编码339个氨基酸,预测其蛋白分子量为36.37 kD,等电点为5.92,为亲水蛋白,不含信号肽序列。综上,本研究成功克隆获得日本蛇根草ANR基因并完成其生物信息学分析,研究结果将为解析该基因的功能奠定基础。

日本蛇根草查尔酮异构酶基因的克隆及其生物信息学分析

查尔酮异构酶(CHI)是类黄酮生物合成过程中的关键酶之一,其在类黄酮的合成过程中发挥着非常重要的作用。本研究以日本蛇根草为研究材料,根据其转录组测序结果设计全长引物,通过RT-PCR方法成功克隆得到日本蛇根草查尔酮异构酶基因完整的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该基因序列全长为702 bp,编码233个氨基酸,预测其蛋白分子量为25.018 k D,等电点为4.95,是亲水性蛋白质,不含有信号肽,很可能定位在叶绿体基质中。同时,二级结构分析显示,日本蛇根草CHI的二级结构分别由96个α螺旋、51个延伸链、86个无规则卷曲组成,这与三维结构预测结果相一致。日本蛇根草CHI基因的克隆对于研究植物类黄酮的生物合成及其分子机制具有重要意义,同时也丰富了双子叶植物CHI基因家族的相关研究。

日本蛇根草无色花青素双加氧酶基因的克隆及其序列分析

无色花青素双加氧酶（LDOX）是花青素合成途径末端的一个关键酶,在该酶的催化作用下,能将无色花色素转变为有色花色素。本研究采用RT-PCR方法成功克隆出日本蛇根草LDOX基因的cDNA序列后,并对其进行了生物信息学分析。分析结果显示,日本蛇根草LDOX基因的cDNA全长为1 041 bp,编码346个氨基酸,理论等电点为5.50,预测其蛋白分子量为38.63 k D,LDOX蛋白为不稳定蛋白,不存在信号肽,很可能定位在细胞质中。二级结构分析显示,其无规则卷曲的含量最高,与三级结构预测结果相符合。日本蛇根草LDOX基因的克隆与生物信息学分析对于进一步研究该类酶的结构和功能以及植物花青素的生物合成具有重要意义。

日本蛇根草Oj3GT1基因的克隆与生物信息学分析

类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(3GT)是花色苷合成途径中首个修饰酶,在花色苷合成与积累过程中起关键作用。本研究以日本蛇根草作为材料,依据其转录组信息设计Oj3GT1基因特异性引物,通过RT-PCR等分子生物学方法,分离并获得Oj3GT1基因的完整cDNA序列,并对Oj3GT1的信号肽、功能结构域、理化参数、亲/疏水性和二级结构等进行了生物信息学分析。根据分析结果可知,Oj3GT1基因的完整CDS长度为1 377 bp,蛋白分子量为50.922 kD,等电点为6.20,属于亲水性蛋白质,不含有信号肽。同时二级结构分析结果显示,Oj3GT1的蛋白二级结构主要是以不规则卷曲为主。综上所述,Oj3GT1基因的克隆与生物信息学分析,将为日本蛇根草花色苷的生物合成研究提供科学依据,同时也为通过基因工程方法调控和改变日本蛇根草花色苷的合成提供理论支撑。

日本蛇根草糖基转移酶基因Oj GT1的克隆与生物信息学分析

糖基转移酶(GTs)是花色苷合成过程中最重要的修饰酶之一,其在花色苷合成过程中发挥重要作用。本研究以日本蛇根草为材料,依据其转录组测序结果,设计引物通过RT-PCR方法成功克隆得到OjGT1基因完整的cDNA序列,随后对OjGT1的功能结构域、生理和化学参数、亲/疏水性、信号肽,二级结构等进行生物信息学分析。分析结果显示,OjGT1基因完整的CDS长度为1 413 bp,翻译形成蛋白的分子量为52.087 kD,等电点为5.12,编码形成亲水性蛋白质,不含信号肽。同时二级结构与三级结构分析显示,OjGT1蛋白结构主要以不规则卷曲为主,其次是α螺旋,延伸链所占比重最小。OjGT1基因的成功克隆与生物信息学分析,将为后续研究茜草目其它植物糖基转移酶提供参考,同时也为日本蛇根草花色苷的生物合成研究提供科学依据。

日本蛇根草转录组数据的功能注释及SSR标记开发

日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)具有很好的观赏价值和药用价值,但基因组信息相对缺乏,导致其分子生物学和基因功能的研究受到限制。为了获得和挖掘日本蛇根草的基因数据和功能,本研究利用日本蛇根草RNA-seq转录组数据进行分析,总共产生8.48 GB数据;对所有单基因在KEGG通路数据库进行分析,共有131913个单基因被分配给KO(KEGG orthology),并定位到20个二层通路129个不同的通路。Unigene功能注释,获得GO分类条目134644条Unigenes;获得COG注释Unigenes 67961条,其中通用预测Unigenes最多。在28483条单基因簇中获得37070个简单重复序列(SSR),出现频率为16.25%,发生频率为12.49%,其平均长度为20 bp。通过设计进行筛选获取20379对SSR引物,随机筛选50对引物进行验证证明SSR引物具备有效性,日本蛇根草SSR位点具有较高的多态性潜能,对遗传多样性的鉴定具有潜在的开发价值。综上所述,本研究提供了有价值的基因研究和分子研究的信息来源,将为功能基因的克隆、基因表达、分子标记开发和遗传多样性研究提供帮助。

日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)OjDFR2基因的克隆及其可溶性重组蛋白的制备

二氢黄酮醇4-还原酶是将二氢黄酮醇转变为花色苷的关键酶,同时也是改变植物呈色的重要调控点。本研究在克隆得到日本蛇根草DFR2基因的基础上,将该基因插入原核表达载体pET32a,完成重组表达质粒pET32a-OjDFR2的构建,同时利用冻融法将该质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞中用于重组蛋白的表达。随后,在不同IPTG浓度、诱导温度及诱导时间下摸索BL21-pET32a-OjDFR2可溶性重组蛋白的最佳诱导表达条件,并通过洗脱、透析与浓缩完成重组蛋白的纯化。研究结果显示,该重组蛋白最佳诱导表达条件为:IPTG浓度0.2 mmol/L,15℃条件下诱导36 h。按照上述条件,制备并纯化获得了大量可溶性重组蛋白,为后续研究OjDFR2的酶学性质及生物学功能提供参考。

湘西产两种蛇根草中喜树碱含量的比较研究

首次以湘西产日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)和广州蛇根草(Ophiorrhiza cantoniensis Hance)为材料,采用乙醇浸取法提取其茎、叶中喜树碱,并用高效液相色谱法分析其含量.报道了湘西产两种蛇根草中均含有喜树碱,日本蛇根草茎、叶中喜树碱含量分别为0.00684%、0.00546%;广州蛇根草茎、叶中喜树碱含量分别为0.00275%、0.00153%,结果表明湘西产日本蛇根草中喜树碱含量较广州蛇根草高.