重组早孕因子(EPF)的表达、纯化及鉴定

目的:获取大量具有良好生物活性的早孕因子(EPF)重组蛋白。方法:从HeLa细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增EPF cDNA,将该cDNA插入载体pGEX-5X-1,获得重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF,将重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF转化大肠杆菌BL21后通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠亲和层析方法,分离纯化得到纯重组GST-EPF融合蛋白(rEPF)。再用Xa酶切GST,得到纯化的EPF重组蛋白。用SDS-PAGE鉴定其纯度,用Western blotting鉴定其特异性,用玫瑰花环抑制试验(RIT)检测其生物学活性。结果:HeLa细胞总RNA中有效扩增出EPF cDNA。EPF cDNA以正确的阅读框架插入表达载体pGEX-5X-1,经IPTG诱导后高效表达EPF重组蛋白。Western blotting表明其与抗EPF抗体有特异性结合,RIT检测结果显示目的蛋白具有良好的EPF生物学特性。结论:成功构建了EPF的原核表达载体,并纯化获得了具有生物学特性的重组蛋白,为进一步开展EPF蛋白的相关研究奠定了基础。

应用Ea玫瑰花环抑制试验检测奶牛血清EPF活性

应用人淋巴细胞玫瑰花环抑制试验,对河南省奶牛育种中心20头奶牛进行了EPF活性检测。结果表明,18～30月龄初配妊娠母牛血清RIT值为12.84±0.59(n=6),31月龄～5岁经产妊娠母牛RIT值为13.01±0.36(n=8),两者差异显著(P<0.05);母牛在妊娠6～28d的RIT值为12.58±0.26(n=6),妊娠1～2个月的RIT值为13.13±0.34(n=6),妊娠3～4个月,RIT值为13.60(n=2),三者相互之间均差异显著(P<0.05)。妊娠与空怀奶牛的RIT值分别为12.96±0.46(n=14)和8.48±0.29(n=6),两者差异极显著(P<0.01)。经产牛血清EPF活性高于初配妊娠母牛;在6～28d、1～2个月、3～4个月3个妊娠期,母牛血清中EPF活性增加;未妊娠奶牛血清中不存在EPF活性,妊娠母牛的RIT>12。说明应用人淋巴细胞玫瑰花环抑制试验进行奶牛的早期或超早期妊娠诊断是一种有效可行的方法。

牦牛EPF的原核表达及多克隆抗体制备

本试验旨在制备牦牛早孕因子(early pregnancy factor,EPF)多克隆抗体,为牦牛妊娠早期高效快速诊断技术研究奠定基础。采用RT-PCR方法,从牦牛胎盘和卵巢组织中提取RNA,反转录为模板后进行EPF基因扩增,并将其克隆到改造后的载体pET28-His10-Sumo上,构建pET28-His10-Sumo-EPF重组质粒,经PCR和测序鉴定后将阳性重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中。用IPTG诱导表达并优化表达条件,使用His标签镍柱纯化重组EPF蛋白并免疫小鼠制备抗体。结果显示,经PCR扩增的牦牛EPF基因在300 bp左右,符合预期结果,并通过测序验证获得重组阳性质粒。pET28-His10-Sumo-EPF重组质粒转化后经IPTG的诱导,表达分子质量大小为29 ku的蛋白(其中包括早孕因子目标蛋白和SUMO标签蛋白),且在37℃、IPTG浓度为300 nmol·L^(-1)、诱导6 h时获得最高表达量。Western blot结果显示,蛋白在上清和包涵体中均有表达,免疫后的小鼠抗血清能够与纯化后的重组蛋白发生免疫反应。本试验通过原核表达系统成功表达了重组牦牛EPF蛋白,制备了免疫原性较好的鼠抗EPF多克隆抗体。