人乳头瘤病毒58型截短型L1蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6的融合表达及其抗血清的制备

目的原核表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型截短型L1(Truncated L1,tL1)蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6(Early secreted antigenic target-6,ESAT-6)融合蛋白,并制备其抗血清。方法利用PCR技术分别从HPV基因组DNA和ESAT-6-18T质粒DNA中扩增tL1和ESAT-6基因,构建重组原核表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a,分别转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白ESAT-6-tL1经镍离子亲和层析柱纯化后免疫昆明小鼠,ELISA检测血清抗体效价。结果 PCR扩增出750 bp的tL1基因片段和320 bp的ESAT-6基因片段,测序结果与GenBank登录的序列一致;重组表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a经双酶切鉴定,构建正确;表达的ESAT-6-tL1融合蛋白相对分子质量约40 000,在E.coli Rosetta中的表达形式为包涵体,纯化后纯度为85%,免疫小鼠血清抗体效价为1:4 000。结论成功表达了ESAT-6-tL1融合蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研制检测HPV58的抗体奠定了基础。

支气管肺泡灌洗液中β-联蛋白、转化生长因子β_1、Clara细胞分泌蛋白16、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6在支气管肺发育不良中的表达及意义

目的探讨β-联蛋白、转化生长因子β1(TGF-β1)、Clara细胞分泌蛋白16(cc16)、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6(KL-6)在支气管肺发育不良(BPD)患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)中的表达及其意义。方法机械通气早产儿70例,其中40例诊断为BPD的患儿作为观察组,30例非BPD患儿作为对照组。采用酶联免疫吸附试验法检测两组患儿机械通气1、24、48、72hBALF中β-联蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平。结果观察组平均胎龄及出生体质量显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),吸氧时间及机械通气时间显著长于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。随机械通气时间的延长,观察组cc16水平呈逐渐降低趋势,而β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐渐升高趋势,且48、72h时均与1h时各指标水平差异有统计学意义(P<0.01)。对照组TGF-β1、cc16于机械通气72h时与1h时水平差异有统计学意义(P<0.01),而β-联蛋白、KL-6水平在各时间点的差异均无统计学意义(P>0.05)。观察组机械通气各时间点β-联蛋白、TGF-β1水平均显著高于对照组各相应时间点指标水平,cc16显著低于对照组水平,差异有统计学意义(P<0.05),而KL-6在机械通气48、72h时高于对照组相应时间点,差异有统计学意义(P<0.05),余时间点差异无统计学意义(P>0.05)。各时间点比较,BPD中重度组β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平均显著高于轻度组,差异有统计学意义(P<0.05),而cc16水平显著低于轻度组,差异有统计学意义(P<0.05)。多元逐步回归分析结果显示,机械通气时间、吸氧时间的延长及低cc16水平是BPD发生的危险因素(P<0.01)。结论机械通气早产儿BPD的发生与机械通气、吸氧时间的延长及低cc16水平密切相关,通过监测早产儿初始机械通气BALF中β-联蛋白、TGF-β1、cc16水平可对早产儿BPD的发生提供预测依据。

结核分枝杆菌6 kD早期分泌靶抗原单克隆抗体的制备及其特异性分析

目的制备结核分枝杆菌(Mtb)6 kD早期分泌靶抗原(ESAT-6)单克隆抗体(mAb)并分析其特异性。方法用亲和层析法纯化目的蛋白ESAT-6,并用该蛋白免疫小鼠。分离免疫小鼠的脾细胞并与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌mAb的杂交瘤细胞系。制备腹水并纯化mAb。酶联免疫吸附试验法分析mAb亚类和相对亲和力,蛋白印迹法检测其特异性。结果制备了可分泌ESAT-6抗体的杂交瘤细胞系,获得了纯化的mAb。mAb亚型为IgG1,相对亲和力为3.9×10^(-5)。该mAb可特异性识别Mtb的ESAT-6。结论制备抗ESAT-6的mAb为ESAT-6用于结核病诊断与防治制剂及其机制研究奠定了基础。

结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6研究新进展

结核分支杆菌的多种分泌蛋白已成为现今对该菌研究的热点,如Ag85复合物、MPT64、ESAT-6及Mtb8.4等,其中结核分支杆菌早期分泌性抗原靶(ESAT-6)是从结核杆菌短期培养滤波(ST-CF)中分离的一种低分子量分泌性蛋白,具有较强的细胞免疫活性,在卡介苗(BCG)各菌株中缺乏其编码基因,可望成为人和动物结核病的特异性诊断试剂、抗结核病亚单位疫苗的侯选抗原和结核病DNA疫苗的侯选目的基因。

结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白原核载体的构建及在E.coli中的高效表达

目的获得高效表达的结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白(ESAT-6)。方法利用PCR方法扩增出ESAT-6基因片段,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-21b(+),酶切分析和序列测定鉴定出ESAT-6基因的阳性重组子,将其转化入E.coliBL21(DE3),阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;重组蛋白经Ni-NTAHis.BindResins纯化。结果成功扩增出ESAT-6基因片段,构建了重组表达质粒pET-ESAT-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别。结论利用pET原核表达系统成功的对结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白进行高效表达和纯化,重组蛋白具有良好的免疫活性。

6 kD早期分泌型抗原靶点(ESAT6)抑制巨噬细胞的自噬并促进BCG的增殖

目的 6 kD早期分泌型抗原靶点(ESAT6)能够促进卡介苗(BCG)的增殖,巨噬细胞的自噬功能能有效杀伤BCG,研究ESAT6与自噬的相互作用,为揭示ESAT6介导的免疫逃逸提供实验依据。方法分别观察对照质粒pCMV-HA和重组质粒pCMV-HA-ESAT6转染以及Earle平衡盐溶液(EBSS)处理的小鼠RAW264.7巨噬细胞中BCG的生长情况,Western blot法检测转染pCMV-HA-ESAT6的RAW264.7细胞0、8、12、24、32 h后,微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白水平。转染pCMV-HA、pCMV-HA-ESAT6、氯喹(CQ)单独处理和CQ与pCMV-HA-ESAT6转染联合处理条件下,Western blot法检测LC3的水平,Lyso Tracker Red染料法计数溶酶体数量,观察罗琴培养基上BCG的情况。结果 pCMV-HA-ESAT6转染的RAW264.7细胞中BCG的生长旺盛,而EBSS处理组生长受抑制;在0、8、12、24、32 h,pCMV-HA-ESAT6转染的RAW264.7细胞中LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转换逐渐增强;与对照组相比,溶酶体荧光探针Lyso Tracker Red染色法显示pCMV-HA-ESAT6、CQ以及CQ与pCMV-HA-ESAT6转染处理组的溶酶体较多且体积大,但后三组间均无显著性差异;pCMV-HA-ESAT6、CQ以及CQ与pCMV-HA-ESAT6转染处理组的BCG生长旺盛。结论 ESAT6抑制RAW264.7细胞内的自噬水平,并且能够促进RAW264.7细胞中感染BCG的生长。

转化生长因子-β1、Clara细胞分泌蛋白16、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6与支气管肺发育不良的相关性研究

目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、克拉拉细胞分泌蛋白16(clara cell secretory protein,CC16)、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6 (krebs yon denlungen-6,KL-6)在支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)大鼠肺组织中的表达,以及这些蛋白的表达与肺细胞凋亡的关系。方法按随机数字表法随机将SD新生鼠随机分为对照组、模型组,模型组持续暴露在80%~85%氧中构建BPD模型,对照组始终暴露在空气中。每组在7 d,14 d,21 d时(简称为7 d模型组、14 d模型组、21 d模型组)随机选出8只新生鼠处死,留取5 m L血清。HE染色观察各组肺组织病理学改变,并分析辐射状肺泡计数(radial alveolar count,ROC),肺泡平均截距(mean linear intercept,MLI)。TUNEL染色检测各组肺组织中的细胞凋亡。ELISA检测各组新生鼠的血清中TGF-β1、CC16、KL-6的水平。Western blot检测各组肺组织中TGF-β1、CC16、KL-6的表达水平。同时分析肺组织中TGF-β1、CC16、KL-6的表达与肺组织细胞凋亡率的关系。结果与正常组相比,模型组肺组织随暴露氧时间的延长BPD损伤加剧,RAC、血清中CC16的水平以及肺组织中CC16的表达明显减少,MLI、细胞凋亡率、血清中TGF-β1、KL-6的水平,肺组织中TGF-β1、KL-6的表达明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示,模型组新生鼠肺组织中TGF-β1、KL-6的表达与肺组织的细胞凋亡率呈正相关(r=0.977、0.970,均P=0.000),CC16的表达与细胞凋亡率呈现负相关(r=-0.982,P=0.000)。结论肺组织中TGF-β1、CC16、KL-6的表达与BPD肺组织的细胞凋亡密切相关。

脑脊液早期分泌性靶抗原-6水平的动态变化及对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨脑脊液早期分泌性靶抗原-6(ESAT-6)水平的动态变化对结核性脑膜炎早期诊断的意义。方法结脑病人50例,其中确诊者10例,临床诊断40例,非结核病对照40例,健康对照10例。间接酶联免疫吸附试验检测各组ESAT-6水平。结果间接ELISA方法检测脑脊液中的ESAT-6,敏感性88%,特异性92%,结脑组早期脑脊液ESAT-6含量较对照组明显升高,抗痨治疗6 w后脑脊液ESAT-6含量明显下降。结论应用间接酶联免疫吸附试验测定脑脊液中ESAT-6水平诊断结脑是可靠的,其动态变化有助于判断结脑预后。

脑脊液改良抗酸染色联合单核细胞内早期分泌抗原靶-6测定用于结核性脑膜炎早期诊断的研究

目的探寻结核性脑膜炎（TBM）早期诊断的新方法。方法选取徐州医科大学附属医院神经内科2013年5月-2015年2月收治的TBM患者38例及其他中枢神经系统感染患者38例。所有病例入院后24-48h内，腰椎穿刺脑脊液（CSF）并予常规检测，同时采用传统集菌法涂片抗酸染色检测结核分枝杆菌（MTB）、改良抗酸染色检测MTB、免疫细胞化学染色及酶联免疫吸附法（ELISA）测定早期分泌抗原靶-6（ESAT-6）。结果①改良抗酸染色检测MTB的灵敏度（Se）达71．1％，与传统抗酸染色（Se为2．6％）比较，差异有统计学意义（P=0．000）；改良抗酸染色图片中，单核细胞、中性粒细胞内见到MTB，同时淋巴细胞内也发现MTB；在同一样本中，MTB以短棒状、点状、球形及细长弯曲型等多种形态存在。②免疫细胞化学染色诊断TBM的Se为84．2％，Sp为89．5％；单核细胞表达ESAT-6最为常见，中性粒细胞、淋巴细胞内也存在ESAT-6表达现象。③CSF改良抗酸染色联合免疫细胞化学ESAT-6检测诊断TBM的Se为89．5％，与改良抗酸染色比较，差异有统计学意义（P=0．044）；联合检测的Sp为89．5％，与免疫细胞化学染色比较差异无统计学意义（P=0．169）。结论CSF改良抗酸染色联合单核细胞内ESAT-6测定可以提高诊断TBM的灵敏度。

ESAT-6联合多项检测指标评估抗结核药物性肝损伤严重程度的关系

目的 检测ESAT-6联合IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7和MMP-9在抗结核药物性肝损伤(ATB-DILI)患者血清中的表达水平,分析上述指标与肝损伤严重程度的相关性,探讨7种因子对ATB-DILI的评估价值。方法 纳入2019年1月至2023年1月就诊于昆明市第三人民医院的肺结核患者,使用ELISA方法检测210例ATB-DILI的肺结核患者(A组)、120例抗结核治疗未发生肝损伤的肺结核患者(B组)及50例健康体检者(C组)血清中的ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7、MMP-9水平,分析上述指标与肝损伤严重程度的相关性,以及评估肝损伤严重程度的准确性。结果 3组人群一般检查结果比较,A组患者年龄高于B、C组(P <0.05)。与对照组比较,A组血清ESAT-6、IL-10、CK-18、MMP-7和MMP-9表达上调,B组ESAT-6和MMP-7表达上调(P <0.05)。其中,A组CK-18、IL-10和MMP-9的表达量高于B组(P <0.05)。A组的年龄、ESAT-6、CK-18和MMP-9与肝损伤严重程度呈正相关关系(P <0.05)。Logistic回归分析显示,A组患者年龄>65岁、ESAT-6>31.3 pg/m L、CK-18>45.5 ng/m L是ATB-DILI的独立危险因素。结论 高龄患者更易发生ATB-DILI,ESAT-6、CK-18和MMP-9升高与ATB-DILI严重程度有关。年龄>65岁、ESAT-6>31.3 pg/m L、CK-18>45.5 ng/m L是ATB-DILI的独立危险因素,联合检测高龄患者ESAT-6和CK-18表达水平,对预判及评估ATB-DILI严重程度具有较高的临床价值。

结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定

目的 用 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白 (ESAT - 6 )基因构建真核表达重组质粒pcDNA3 1(+) -ESAT - 6 ,并鉴定其在真核细胞 (COS - 7)中的蛋白表达。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体pUCm -T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR反应产物克隆于真核表达载体 pcDNA3 1(+)上。并用脂质体介导真核表达重组质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT - 6转染真核细胞COS - 7,72h后 ,通过SDS -PAGE和免疫印迹鉴定ESAT - 6基因表达的蛋白。结果 用结核杆菌基因ESAT - 6构建重组真核表达质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT-成功 ,通过SDS -PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量 6kDa的特异蛋白 ,免疫印迹证明该 6kDa蛋白能与抗ESAT - 6单克隆抗体反应。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒成功构建 ,该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6。

结核分枝杆菌19kD-ESAT6融合蛋白的克隆表达及纯化

运用聚合酶链反应(PCR)技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv中扩增获得19kD脂蛋白和esat-6基因片段,将目的片段分别克隆到pMD18-T载体,再亚克隆目的片段到同一表达载体pET-21a,构建重组表达载体pET21a-19kD-ESAT6,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),表达纯化后用蛋白质印迹法(Western blot)分析其抗原反应性。结果成功构建了重组质粒pET21a-19kD-ESAT6,并在大肠埃希菌中获得高效表达。SDS-PAGE结果显示,在相对分子质量(Mr)约29×103处有表达条带。Western blot结果表明,重组蛋白19kD-ESAT6与确诊的结核病患者血清发生特异性免疫反应,具有特异的抗原性。本研究构建的结核分枝杆菌19kD-ESAT6融合蛋白为结核病血清学诊断试剂的开发提供了依据。

ESAT-6 INF-γ和ADA在结核性脑膜炎早期诊断中的应用

目的探讨早期分泌性靶抗原-6（ESAT-6）、干扰素-γ（INF-γ）和腺苷脱氨酶（ADA）在结核性脑膜炎患儿早期诊断中的应用价值。方法采甩酶联免疫吸附试验（ELISA）检测EsAT-6和INF-γ水平，采用酶动力学终点法检测ADA水平，并将各组结果进行对比分析。结果结核性脑膜炎患儿急性期ESAT-6、INF-γ和ADA浓度均显著高于其恢复期水平和对照组（P〈0．05）。重症组ESAT-6、INF-γ和ADA浓度均显著高于轻症组，轻症组明显高于对照组（P〈0．05）。单项检测阳性率较低，三项联合检测能提高阳性检出率。结论ESAT-6、INF-γ和ADA对结核性脑膜炎患儿早期诊断具有重要的临床价值，三者联合检测能减少漏诊。

和厚朴酚抑制CFP-10、ESAT-6诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞炎症因子表达

目的 研究和厚朴酚（HNK）对早期分泌抗原靶蛋白6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP-10）作为特异性抗原刺激人肺泡Ⅱ型上皮细胞（A549）炎症因子表达的抑制作用,探讨抗炎在结核病治疗中的潜在价值.方法 用MTS法检测HNK（0～80μmol/L）对A549细胞的毒性反应,确定合适的药物实验浓度.用ELISA法检测以CFP-10、ESAT-6（0～40μg/ml）为抗原刺激的A549表达IL-8水平,选择最适刺激浓度.将A549细胞与CFP-10,ESAT-6及不同浓度的HNK（0～20μmol/L）共同培养24h后收集培养上清液和细胞,用ELISA法检测各组培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及Rantes的表达水平,分析HNK对细胞因子的剂量依赖抑制.结果 20μmol/L及以下的HNK浓度对A549细胞无明显毒性反应.抗原最适刺激浓度为5μmol/L.CFP-10,ESAT-6刺激可显著诱导A549细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及Rantes的产生.HNK（0～20μmol/L）剂量依赖性地抑制CFP-10,ESAT-6诱导的炎症因子的表达.结论 HNK能有效抑制CFP-10,ESAT-6诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞炎性细胞因子的表达.

小鼠巨噬细胞内表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对细胞增殖和凋亡的影响

目的:建立培养滤液蛋白10-早期分泌性抗原靶6(CFP10-ESAT6)真核表达质粒并转染RAW264.7巨噬细胞,观察胞内表达CFP10-ESAT6对细胞活性及凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法:将CFP10-ESAT6融合基因插入真核表达质粒pEGFP-N1,构建重组质粒,转染RAW264.7巨噬细胞。采用MTT的方法测定CFP10-ESAT6融合蛋白对RAW264.7巨噬细胞活性的影响,采用结核分枝杆菌19 kD脂蛋白和十字孢碱(staurosporine)处理RAW264.7巨噬细胞,并以流式细胞术检测细胞凋亡率以及Toll样受体2(TLR2)的表达。结果:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6并转染至RAW264.7巨噬细胞;与对照组相比,胞内表达CFP10-ESAT6不能影响巨噬细胞的活性,但可以明显抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡(P<0.05),并显著抑制了TLR2的表达(P<0.05)。结论:巨噬细胞内表达的CFP10-ESAT6融合蛋白不具有细胞毒性作用,但可以通过下调TLR2的表达来抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白免疫小鼠效果初步评价

目的融合表达和纯化结核分枝杆菌(MTB)CFP10-ESAT6(CE),初步评价免疫效果。方法构建pET32a(+)-CE重组质粒,E.coli BL21(DE3)中融合表达,Ni-NTA层析纯化。用CE加铝佐剂,50μg CE/只/次,分3次免疫BALB/c小鼠。ELISA测定血清IgG抗体;ELISpot与Luminex检测细胞因子,进行MTB体外生长抑制试验。卡介苗(BCG)为阳性对照。结果CE免疫小鼠,能诱导产生高效价的IgG、IgG1和IgG2a,且IgG1(t=19.1,P<0.0001)和IgG2a(t=8.7,P<0.0001)抗体水平均高于BCG组。CE组与BCG组诱导产生的分泌IFN-γ的斑点形成细胞(SFC)数量差异无统计学意义(t=0.4,P>0.05),但诱导分泌IL-4的SFC数量高于BCG组(t=8.0,P<0.0001)。CE组诱导分泌GM-CSF(t=8.4,P<0.05)、IL-6(t=8.3,P<0.05)、IL-10(t=2.5,P<0.05)和IL-4(t=7.0,P<0.05)均高于BCG组,而CE组诱导分泌IFN-γ(t=1.4,P>0.05)、TNF-α(t=1.8,P>0.05)、IL-2(t=2.0,P>0.05)、IL-12(t=0.9,P>0.05)和IL-17(t=1.3,P>0.05)均与BCG组相似,差异无统计学意义。CE组小鼠脾细胞的MTB体外生长抑制结果与BCG组相似(t=0.8,P>0.05)。结论CE免疫小鼠可诱导较强的Th1与Th2混合型免疫反应,且有较强的体外抑制MTB生长的能力,表明CE具有良好的结核疫苗研制应用价值。

近红外荧光标记-免疫磁珠偶联法定量检测结核分枝杆菌ESAT-6蛋白

目的建立定量检测结核分枝杆菌早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)的近红外荧光标记-免疫磁珠偶联法。方法以近红外荧光染料(Dylight 800)标记靶向ESAT-6的单克隆抗体,靶向ESAT-6的多克隆抗体包被在纳米磁珠表面。采用双抗体夹心法,磁性分离结合物和游离物,采用便携式高灵敏度低噪声激发式荧光检测仪检测磁性结合物的荧光强度,从而检测待检样品中ESAT-6水平。结果该方法的检测线性范围为2.4~750.0ng/mL,最低检测限为0.48ng/mL;10ng/mL水平加样回收率为96%,50ng/mL水平加样回收率为95%;批间变异系数(CV)为5.8%,批内CV为4.3%。该方法检测胸腔积液标本ESAT-6的特异度为80%,灵敏度为95%。结论该方法检测ESAT-6的线性范围广、灵敏度高、稳定性好。

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达及纯化研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达系统,建立表达及纯化方法,为其应用打下基础。方法根据ESAT-6的基因序列设计引物,从结核菌基因组DNA中扩增基因,酶切后插入表达载体,测序证实后转入大肠杆菌JM109菌株,经IPTG诱导表达,产物经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶法纯化。结果ESAT基因产物大小、酶切片断大小和载体的大小与设计一致、ESAT-6基因测序的结果与目的基因完全符合。表达纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。结论构建结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达载体成功,纯化出目的蛋白。

结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶-6和滤液培养蛋白10及脂阿拉伯甘露聚糖联合检测对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶-6(ESAT-6)、滤液培养蛋白10(CFP-10)和脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)联合检测对结核性脑膜炎的诊断价值。方法选取2013年1月至2015年12月在台州市第一人民医院住院的结核性脑膜炎36例(结脑组)和病毒性脑膜炎30例(非结脑组)为研究对象,用常规和生化方法检测脑脊液的细胞计数、葡萄糖、蛋白质和氯化物,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑脊液中ESAT-6、CFP-10和LAM浓度,并用SPSS 14.0软件对两组数据进行t检验。结果结脑组脑脊液细胞计数和蛋白质浓度明显高于非结脑组,差异有统计学意义(t值分别为11.38、9.62,P<0.05),葡萄糖和氯化物浓度明显低于非结脑组,差异均有统计学意义(t值分别为-6.90、-11.92,P<0.05);结脑组ESAT-6、CFP-10和LAM浓度[分别为(36.50±9.14)pg/ml、(298.71±31.56)pg/ml、(8.62±2.35)mg/ml]明显高于非结脑组[分别为(7.84±0.86)pg/ml、(35.32±11.80)pg/ml、(5.13±1.74)mg/ml],差异均有统计学意义(P<0.05);ESAT-6、CFP-10、LAM检测阳性率偏低,联合检测能提高诊断效能,其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和约登指数分别为88.89%、93.33%、94.12%、87.50%和0.822 2。结论脑脊液中ESAT-6、CFP-10和LAM联合检测对结核性脑膜炎的早期诊断具有一定的实用价值。

抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6的新型单克隆抗体的制备及其临床应用

目的制备抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)单克隆抗体,以应用于多种检测技术和临床研究。方法设计并合成结核分枝杆菌ESAT-6特定抗原肽序列,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测、多次有限稀释亚克隆建立能稳定分泌抗结核分枝杆菌特异抗原肽单克隆抗体的杂交瘤细胞系,纯化后行免疫球蛋白亚型分析,并鉴定分析该单克隆抗体在蛋白质免疫印迹法、免疫沉淀法和酶联免疫法(ELISA)检测中的应用效果。收集结核分枝杆菌培养上清液样本38份,非结核分枝杆菌培养上清液样本20份,结核性胸水样本32份,非结核性胸水样本24份以及健康对照血清样本20份。结果单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示抗体类型为IgM、κ型,并可应用于Western blotting和免疫沉淀法。ELISA定量检测显示该特异性抗体检测结核分枝杆菌的敏感度为95.7%(67/70),特异度为100%(64/64)。结论 ESAT-6单克隆抗体用于结核分枝杆菌检测有较高的敏感性和特异性,可用于结核病的早期诊断。