基因释放剂在制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板中的应用

目的 :探讨基因释放剂的应用并为结核病DNA疫苗的研究提供靶基因。方法 :分别用基因释放剂提取法与DNA提取试剂盒提取法制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板 ,采用PCR法从模板中扩增早期分泌性抗原靶 (ESAT - 6 )基因并测序证实所扩增的基因是否为目的基因。结果 :从基因释放剂提取法与DNA提取试剂盒提取法制备的DNA模板中均成功地扩增出了目的基因ESAT - 6。结论 :基因释放剂提取法制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板方便、快捷 ,提高了制备DNA模板效率。

脑脊液单核细胞早期分泌性抗原靶-6联合脑脊液阿拉伯糖甘露糖脂抗体对结核性脑膜炎的诊断价值研究

目的探讨脑脊液单核细胞早期分泌性抗原靶-6(ESAT-6)联合脑脊液阿拉伯糖甘露糖脂(LAM)抗体对结核性脑膜炎的诊断价值。方法选择2010年1月—2014年8月在新乡医学院第一附属医院住院的结核性脑膜炎患者49例作为结核性脑膜炎组,化脓性脑膜炎患者28例作为化脓性脑膜炎组,病毒性脑膜炎患者24例作为病毒性脑膜炎组,同期体检健康者60例作为正常对照组。各组受检者均进行脑脊液细胞学检查和生化检查,脑脊液单核细胞ESAT-6及LAM抗体检测,并通过绘制ROC曲线评价脑脊液单核细胞ESAT-6、脑脊液LAM抗体及二者联合(并联试验)对结核性脑膜炎的诊断效能。结果 4组受检者脑脊液白细胞计数、中性粒细胞分数、淋巴细胞分数及单核细胞分数比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。4组受检者脑脊液蛋白含量、糖含量、氯化物含量比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。脑脊液单核细胞ESAT-6诊断结核性脑膜炎的曲线下面积(AUC)为0.876〔95%CI(0.764,0.910)〕,取最佳临界值时灵敏度为89.80%、特异度为96.43%;脑脊液LAM抗体诊断结核性脑膜炎的AUC为0.852〔95%CI(0.560,0.890)〕,取最佳临界值时灵敏度为55.10%、特异度为100.00%;两者联合诊断结核性脑膜炎的AUC为0.924〔95%CI(0.850,1.000)〕,取最佳临界值时灵敏度为92.00%、特异度为97.30%。结论脑脊液单核细胞ESAT-6联合脑脊液LAM抗体对结核性脑膜炎的诊断效能较高,有助于提高诊断结核性脑膜炎的灵敏度。

抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6的新型单克隆抗体的制备及其临床应用

目的制备抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)单克隆抗体,以应用于多种检测技术和临床研究。方法设计并合成结核分枝杆菌ESAT-6特定抗原肽序列,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测、多次有限稀释亚克隆建立能稳定分泌抗结核分枝杆菌特异抗原肽单克隆抗体的杂交瘤细胞系,纯化后行免疫球蛋白亚型分析,并鉴定分析该单克隆抗体在蛋白质免疫印迹法、免疫沉淀法和酶联免疫法(ELISA)检测中的应用效果。收集结核分枝杆菌培养上清液样本38份,非结核分枝杆菌培养上清液样本20份,结核性胸水样本32份,非结核性胸水样本24份以及健康对照血清样本20份。结果单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示抗体类型为IgM、κ型,并可应用于Western blotting和免疫沉淀法。ELISA定量检测显示该特异性抗体检测结核分枝杆菌的敏感度为95.7%(67/70),特异度为100%(64/64)。结论 ESAT-6单克隆抗体用于结核分枝杆菌检测有较高的敏感性和特异性,可用于结核病的早期诊断。

脑脊液细胞中结核早期分泌性靶抗原6的检测及其早期诊断价值

目的探讨免疫荧光染色法检测脑脊液细胞中结核早期分泌性靶抗原6(ESAT-6)对结核性脑膜炎诊断的价值。方法收集36例确诊结核性脑膜炎患者的脑脊液为病例组,45例非结核性脑膜炎患者脑脊液为对照组。用双盲法对2组脑脊液细胞进行ESAT-6免疫荧光染色,统计分析灵敏度和特异度等。结果病例组ESAT-6存在于中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞中,对照组脑脊液细胞中无ESAT-6表达。灵敏度为88.89%、特异度为93.33%;阳性预测值为91.43%、阴性预测值为91.30%;阳性似然比为13.33、阴性似然比为0.12;Youden指数为82.22%,ROC曲线下面积为0.94。结论免疫荧光染色检测脑脊液细胞中ESAT-6的灵敏度及特异度均较高,是结核性脑膜炎诊断的有效方法。

脑脊液早期分泌性靶抗原-6水平的动态变化及对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨脑脊液早期分泌性靶抗原-6(ESAT-6)水平的动态变化对结核性脑膜炎早期诊断的意义。方法结脑病人50例,其中确诊者10例,临床诊断40例,非结核病对照40例,健康对照10例。间接酶联免疫吸附试验检测各组ESAT-6水平。结果间接ELISA方法检测脑脊液中的ESAT-6,敏感性88%,特异性92%,结脑组早期脑脊液ESAT-6含量较对照组明显升高,抗痨治疗6 w后脑脊液ESAT-6含量明显下降。结论应用间接酶联免疫吸附试验测定脑脊液中ESAT-6水平诊断结脑是可靠的,其动态变化有助于判断结脑预后。

结核菌早期分泌性靶抗原免疫学研究进展

结核病仍是世界上最严重传染病之一。结核菌早期分泌性靶抗原(ESAT-6)是结核分枝杆菌的一种早期分泌蛋白,它的免疫原性是目前研究热点。本文就ESAT-6在结核菌的致病性,结核病诊断及保护性免疫等方面的研究进展作一综述。

结核分枝杆菌特异性分泌抗原克隆和融合表达及抗原性鉴定

目的融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10,研究其免疫学特性,为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(+)中,构建pET32c(+)-linker。PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因。将CFP10克隆入改建的载体pET32c(+)的linker前,ESAT-6克隆入linker后,构建CFP10-ESAT-6融合基因;或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(+)linker前,CFP10克隆入linker后,构建ESAT-6-CFP10融合基因,分别转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠肝菌BL21中表达,通过Westernblot分析其抗原性。结果二个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c(+)的linker前或后。重组质粒pET32c(+)-CFP10-ESAT-6或pET32c(+)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在BL21菌中高效表达。Westernblot分析表明,融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒;pET32c(+)-CFP10-ESAT-6或pET32c(+)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白,该蛋白兼具CFP10和ESAT-6二种蛋白的抗原性。本研究为rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断的中应用奠定了基础。

ESAT-6 INF-γ和ADA在结核性脑膜炎早期诊断中的应用

目的探讨早期分泌性靶抗原-6（ESAT-6）、干扰素-γ（INF-γ）和腺苷脱氨酶（ADA）在结核性脑膜炎患儿早期诊断中的应用价值。方法采甩酶联免疫吸附试验（ELISA）检测EsAT-6和INF-γ水平，采用酶动力学终点法检测ADA水平，并将各组结果进行对比分析。结果结核性脑膜炎患儿急性期ESAT-6、INF-γ和ADA浓度均显著高于其恢复期水平和对照组（P〈0．05）。重症组ESAT-6、INF-γ和ADA浓度均显著高于轻症组，轻症组明显高于对照组（P〈0．05）。单项检测阳性率较低，三项联合检测能提高阳性检出率。结论ESAT-6、INF-γ和ADA对结核性脑膜炎患儿早期诊断具有重要的临床价值，三者联合检测能减少漏诊。

脑脊液单核细胞内ESAT-6检测对结核性脑膜炎的诊断意义

目的评价检测脑脊液中单核细胞内的早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)对结核性脑膜炎诊断的意义,为结核性脑膜炎的诊断提供有效的方法。方法将20例结核性脑膜炎患者与20例对照组患者进行脑脊液常规、生化、细胞学检查,同时用免疫组化的方法检测脑脊液单核细胞内的ESAT-6及PPD。结果结核性脑膜炎患者单核细胞内存在ESAT-6,在20例结核性脑膜炎患者中14例显示阳性,对照组中1例阳性,结核性脑膜炎组单核细胞内ESAT-6阳性检出率显著高于对照组,(P<0.05),该方法诊断结核性脑膜炎敏感性为70%,特异性为95%,约登指数0.65。结核性脑膜炎组单核细胞内PPD阳性检出率显著高于对照组,(P<0.05),敏感性为0.65,特异性为0.90,约登指数为0.55。结论检测脑脊液单核细胞中ESAT-6是诊断结核性脑膜炎的一种简便、特异的方法 。

结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达

目的 探讨结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT -6基因真核表达重组质粒在真核细胞 (COS -7)中的表达。 方法 用LipofectAMINETM2 0 0 0介导真核表达重组质粒 pcDNA3 .1(+ ) -ESAT -6转染真核细胞COS -7,72h后 ,通过RT -PCR和WesternBlotting试验鉴定ESAT -6基因在COS -7中的表达。 结果 通过RT -PCR从转染了pcDNA3 .1(+ ) -ESAT -6的COS -7中检测到目的基因mRNA的转录 ;WesternBlotting试验鉴定在转染pcDNA3 .1(+ ) -ESAT -6的COS -7的细胞裂解上清液中有ESAT -6基因的表达蛋白。 结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT -6真核表达重组质粒能够在真核细胞COS -7中表达ESAT -6蛋白 ,为进一步研究其特性及为结核病的诊断。

超滤浓缩脑脊液ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨离心超滤技术浓缩脑脊液检查结核杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)在诊断结核性脑膜炎(TBM)中的价值。方法选取TBM患者40例(TBM组)和非TBM患者20例(非TBM组),每位患者留取2份脑脊液(一份为原液,另一份为离心超滤浓缩),使用ELlSA法检测其ESAT-6水平。结果 TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05),而非TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性与原液比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用离心超滤浓缩技术能提高脑脊液ESAT-6检查的敏感性,且操作简单,可作为快速诊断TBM的参照指标。

ESAT-6和干扰素-γ表达水平在结核性脑膜炎诊断中的应用价值

目的探讨脑脊液早期分泌性靶抗原-6(ESAT-6)和干扰素-γ(IFN-γ)表达水平变化在结核性脑膜炎的临床诊断中的应用价值。方法将2012-05~2016-05延安大学附属医院收治的90例结核性脑膜炎患者为观察组,选择同期住院的90例非结核性脑膜炎患者为对照组。采用ELISA法检测两组患者的脑脊液中的ESAT-6和IFN-γ水平,对观察组按照不同时相(急性期与恢复期)、不同病情程度(重症和轻症)分组进行ESAT-6、IFN-γ水平比较,并比较ESAT-6和IFN-γ单独与联合检测的灵敏性、特异性和阳性结果准确性。结果 1观察组结核性脑膜炎患者急性期的ESAT-6和IFN-γ水平均较对照组明显升高(P<0.05);而观察组结核性脑膜炎患者恢复期的ESAT-6和IFN-γ水平和对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。2观察组重症结核性脑膜炎患者的ESAT-6和IFN-γ水平均较轻症组和对照组明显升高(P<0.05);观察组轻症结核性脑膜炎患者的ESAT-6和IFN-γ水平均较对照组明显升高(P<0.05)。3ESAT-6和IFN-γ联合检测的灵敏性、特异性和阳性结果准确性均较单独ESAT-6、单独IFN-γ检测明显提高(P<0.05)。结论脑脊液ESAT-6和IFN-γ表达水平变化将有助于结核性脑膜炎的早期临床诊断。

结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定

目的 用 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白 (ESAT - 6 )基因构建真核表达重组质粒pcDNA3 1(+) -ESAT - 6 ,并鉴定其在真核细胞 (COS - 7)中的蛋白表达。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体pUCm -T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR反应产物克隆于真核表达载体 pcDNA3 1(+)上。并用脂质体介导真核表达重组质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT - 6转染真核细胞COS - 7,72h后 ,通过SDS -PAGE和免疫印迹鉴定ESAT - 6基因表达的蛋白。结果 用结核杆菌基因ESAT - 6构建重组真核表达质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT-成功 ,通过SDS -PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量 6kDa的特异蛋白 ,免疫印迹证明该 6kDa蛋白能与抗ESAT - 6单克隆抗体反应。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒成功构建 ,该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6。

结核分枝杆菌Hsp65-Esat6与hGM-CSF联合DNA疫苗的构建与体外研究

目的:应用分子生物学技术,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以p EGHsp65Esat-6为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,同时从质粒p ORF-h GM-CSF中扩增出基因佐剂h GM-CSF,分别克隆到真核表达载体p IRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并转染Hep G-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.93 kb和0.47kb,测序分析表明克隆的Hsp65-Esat6和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(h GM-CSF)序列与Gen Bank上公布序列完全一致;Western-bolt检测到Hsp65-Esat6融合蛋白相对分子质量(Mr)为75 000 k Da;RT-PCR方法检测出p IGM,p IHsp65GM和p IHsp65-Esat6GM转染组细胞均有h GM-CSF mRNA表达,三组细胞中h GM-CSF基因mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05).ELISA方法检测到p IHsp65-Esat6GM转染组细胞培养上清中h GM-CSF的表达,且与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:成功构建和表达了p IHsp65-Esat6GM质粒,为研制优于卡介苗(BCG)的新型抗结核病的DNA疫苗奠定了基础.

结核分枝杆菌H37Ra菌株ESAT6基因的克隆及序列分析

目的:从结核分枝杆菌H37Ra菌株克隆早期分泌性抗原靶6(ESAT6)基因并进行序列分析。方法:以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模版,用PCR方法扩增ESAT6基因,将扩增产物连接到克隆载体pTG19-T中,并用PCR、单双酶切和测序进行鉴定,以BLAST软件进行序列比对分析。结果:从结核分枝杆菌H37Ra株成功克隆了ESAT6基因,测序表明该片段由288 bp组成,与GenBank所报告的H37Rv基因相比同源性为100%。结论:成功克隆了H37Ra株ESAT6编码基因,其序列与H37Rv标准株ESAT6编码基因完全一致。

小鼠巨噬细胞内表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对细胞增殖和凋亡的影响

目的:建立培养滤液蛋白10-早期分泌性抗原靶6(CFP10-ESAT6)真核表达质粒并转染RAW264.7巨噬细胞,观察胞内表达CFP10-ESAT6对细胞活性及凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法:将CFP10-ESAT6融合基因插入真核表达质粒pEGFP-N1,构建重组质粒,转染RAW264.7巨噬细胞。采用MTT的方法测定CFP10-ESAT6融合蛋白对RAW264.7巨噬细胞活性的影响,采用结核分枝杆菌19 kD脂蛋白和十字孢碱(staurosporine)处理RAW264.7巨噬细胞,并以流式细胞术检测细胞凋亡率以及Toll样受体2(TLR2)的表达。结果:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6并转染至RAW264.7巨噬细胞;与对照组相比,胞内表达CFP10-ESAT6不能影响巨噬细胞的活性,但可以明显抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡(P<0.05),并显著抑制了TLR2的表达(P<0.05)。结论:巨噬细胞内表达的CFP10-ESAT6融合蛋白不具有细胞毒性作用,但可以通过下调TLR2的表达来抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡。

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达及纯化研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达系统,建立表达及纯化方法,为其应用打下基础。方法根据ESAT-6的基因序列设计引物,从结核菌基因组DNA中扩增基因,酶切后插入表达载体,测序证实后转入大肠杆菌JM109菌株,经IPTG诱导表达,产物经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶法纯化。结果ESAT基因产物大小、酶切片断大小和载体的大小与设计一致、ESAT-6基因测序的结果与目的基因完全符合。表达纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。结论构建结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达载体成功,纯化出目的蛋白。

结核分支杆菌ESAT-6基因蛋白的表达

目的构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶(Early secretary antigenic target,ESAT-6)基因的pET原核表达载体,诱导表达并初步鉴定该蛋白。方法设计特异性引物,用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因,产物通过双酶切克隆入pET-32a(+)质粒,经PCR、酶切、测序等方法鉴定后,转入大肠杆菌BL21菌体中IPTG诱导表达,并经镍柱纯化、Western-blotting鉴定。结果所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致;表达融合蛋白相对分子质量约2.5×104,并能与特异性单抗结合,具有一定免疫学活性。结论成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。

ESAT-6、IL-8和INF-γ在结核性脑膜炎早期诊断中的应用

目的探讨早期分泌性靶抗原-6(ESAT-6)、白细胞介素-8(IL-8)和干扰素-γ(INF-γ)在结核性脑膜炎早期诊断中的应用价值。方法选取2009年6月-2013年5月间在本院住院的结核性脑膜炎患儿57例,非中枢神经系统感染性疾病患儿30例,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ESAT-6、IL-8和INF-γ的水平,并将各项指标进行对比分析。结果结核性脑膜炎组EAST-6、IL-8和INF-γ三项浓度显著高于其恢复期水平,也显著高于对照组水平(P<0.01),结核性脑膜炎组恢复期三项浓度与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。单独检测其中一项,灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值较低,三项指标联合检测能使其达到最大值。结论检测脑脊液中EAST-6、IL-8和INF-γ浓度有助于结核性脑膜炎的早期诊断,其浓度动态变化有助于疗效观察和判断预后。

ESAT6蛋白与结核菌素纯蛋白衍生物联合ELISA法诊断结核病的研究

目的探讨早期分泌性抗原靶6(early secretory antigenic target-6,ESAT-6)、结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)联合进行血清学诊断结核病的效果。方法 ESAT6基因被插入到原核表达载体pGEX-5T中,与谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)融合进行表达。表达的GST-ESAT6融合蛋白经亲和层析和分子筛进行纯化。针对64例结核患者血清和40例健康人血清,进行了ESAT6、PPD抗体反应性实验,评估二者血清学诊断的敏感性和特异性。结果融合表达的ESAT6蛋白保持天然的免疫原性,在Western blot实验中,可以被结核病人血清所识别。PPD抗体诊断敏感性是84.4%,特异性是65%。ESAT6抗体诊断敏感性是68.75%,特异性是95%。ESAT6、PPD-酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)联合诊断,敏感性是93.4%,特异性是95%。结论 ESAT6、PPD抗体联合判断可以提高结核病诊断的准确性。