结核分枝杆菌6 kD早期分泌靶抗原单克隆抗体的制备及其特异性分析

目的制备结核分枝杆菌(Mtb)6 kD早期分泌靶抗原(ESAT-6)单克隆抗体(mAb)并分析其特异性。方法用亲和层析法纯化目的蛋白ESAT-6,并用该蛋白免疫小鼠。分离免疫小鼠的脾细胞并与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌mAb的杂交瘤细胞系。制备腹水并纯化mAb。酶联免疫吸附试验法分析mAb亚类和相对亲和力,蛋白印迹法检测其特异性。结果制备了可分泌ESAT-6抗体的杂交瘤细胞系,获得了纯化的mAb。mAb亚型为IgG1,相对亲和力为3.9×10^(-5)。该mAb可特异性识别Mtb的ESAT-6。结论制备抗ESAT-6的mAb为ESAT-6用于结核病诊断与防治制剂及其机制研究奠定了基础。

结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6研究新进展

结核分支杆菌的多种分泌蛋白已成为现今对该菌研究的热点,如Ag85复合物、MPT64、ESAT-6及Mtb8.4等,其中结核分支杆菌早期分泌性抗原靶(ESAT-6)是从结核杆菌短期培养滤波(ST-CF)中分离的一种低分子量分泌性蛋白,具有较强的细胞免疫活性,在卡介苗(BCG)各菌株中缺乏其编码基因,可望成为人和动物结核病的特异性诊断试剂、抗结核病亚单位疫苗的侯选抗原和结核病DNA疫苗的侯选目的基因。

脑脊液细胞中结核早期分泌性靶抗原6的检测及其早期诊断价值

目的探讨免疫荧光染色法检测脑脊液细胞中结核早期分泌性靶抗原6(ESAT-6)对结核性脑膜炎诊断的价值。方法收集36例确诊结核性脑膜炎患者的脑脊液为病例组,45例非结核性脑膜炎患者脑脊液为对照组。用双盲法对2组脑脊液细胞进行ESAT-6免疫荧光染色,统计分析灵敏度和特异度等。结果病例组ESAT-6存在于中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞中,对照组脑脊液细胞中无ESAT-6表达。灵敏度为88.89%、特异度为93.33%;阳性预测值为91.43%、阴性预测值为91.30%;阳性似然比为13.33、阴性似然比为0.12;Youden指数为82.22%,ROC曲线下面积为0.94。结论免疫荧光染色检测脑脊液细胞中ESAT-6的灵敏度及特异度均较高,是结核性脑膜炎诊断的有效方法。

脑脊液早期分泌性靶抗原-6水平的动态变化及对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨脑脊液早期分泌性靶抗原-6(ESAT-6)水平的动态变化对结核性脑膜炎早期诊断的意义。方法结脑病人50例,其中确诊者10例,临床诊断40例,非结核病对照40例,健康对照10例。间接酶联免疫吸附试验检测各组ESAT-6水平。结果间接ELISA方法检测脑脊液中的ESAT-6,敏感性88%,特异性92%,结脑组早期脑脊液ESAT-6含量较对照组明显升高,抗痨治疗6 w后脑脊液ESAT-6含量明显下降。结论应用间接酶联免疫吸附试验测定脑脊液中ESAT-6水平诊断结脑是可靠的,其动态变化有助于判断结脑预后。

脑脊液改良抗酸染色联合单核细胞内早期分泌抗原靶-6测定用于结核性脑膜炎早期诊断的研究

目的探寻结核性脑膜炎（TBM）早期诊断的新方法。方法选取徐州医科大学附属医院神经内科2013年5月-2015年2月收治的TBM患者38例及其他中枢神经系统感染患者38例。所有病例入院后24-48h内，腰椎穿刺脑脊液（CSF）并予常规检测，同时采用传统集菌法涂片抗酸染色检测结核分枝杆菌（MTB）、改良抗酸染色检测MTB、免疫细胞化学染色及酶联免疫吸附法（ELISA）测定早期分泌抗原靶-6（ESAT-6）。结果①改良抗酸染色检测MTB的灵敏度（Se）达71．1％，与传统抗酸染色（Se为2．6％）比较，差异有统计学意义（P=0．000）；改良抗酸染色图片中，单核细胞、中性粒细胞内见到MTB，同时淋巴细胞内也发现MTB；在同一样本中，MTB以短棒状、点状、球形及细长弯曲型等多种形态存在。②免疫细胞化学染色诊断TBM的Se为84．2％，Sp为89．5％；单核细胞表达ESAT-6最为常见，中性粒细胞、淋巴细胞内也存在ESAT-6表达现象。③CSF改良抗酸染色联合免疫细胞化学ESAT-6检测诊断TBM的Se为89．5％，与改良抗酸染色比较，差异有统计学意义（P=0．044）；联合检测的Sp为89．5％，与免疫细胞化学染色比较差异无统计学意义（P=0．169）。结论CSF改良抗酸染色联合单核细胞内ESAT-6测定可以提高诊断TBM的灵敏度。

结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白原核载体的构建及在E.coli中的高效表达

目的获得高效表达的结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白(ESAT-6)。方法利用PCR方法扩增出ESAT-6基因片段,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-21b(+),酶切分析和序列测定鉴定出ESAT-6基因的阳性重组子,将其转化入E.coliBL21(DE3),阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;重组蛋白经Ni-NTAHis.BindResins纯化。结果成功扩增出ESAT-6基因片段,构建了重组表达质粒pET-ESAT-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别。结论利用pET原核表达系统成功的对结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白进行高效表达和纯化,重组蛋白具有良好的免疫活性。

ESAT-6联合多项检测指标评估抗结核药物性肝损伤严重程度的关系

目的 检测ESAT-6联合IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7和MMP-9在抗结核药物性肝损伤(ATB-DILI)患者血清中的表达水平,分析上述指标与肝损伤严重程度的相关性,探讨7种因子对ATB-DILI的评估价值。方法 纳入2019年1月至2023年1月就诊于昆明市第三人民医院的肺结核患者,使用ELISA方法检测210例ATB-DILI的肺结核患者(A组)、120例抗结核治疗未发生肝损伤的肺结核患者(B组)及50例健康体检者(C组)血清中的ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7、MMP-9水平,分析上述指标与肝损伤严重程度的相关性,以及评估肝损伤严重程度的准确性。结果 3组人群一般检查结果比较,A组患者年龄高于B、C组(P <0.05)。与对照组比较,A组血清ESAT-6、IL-10、CK-18、MMP-7和MMP-9表达上调,B组ESAT-6和MMP-7表达上调(P <0.05)。其中,A组CK-18、IL-10和MMP-9的表达量高于B组(P <0.05)。A组的年龄、ESAT-6、CK-18和MMP-9与肝损伤严重程度呈正相关关系(P <0.05)。Logistic回归分析显示,A组患者年龄>65岁、ESAT-6>31.3 pg/m L、CK-18>45.5 ng/m L是ATB-DILI的独立危险因素。结论 高龄患者更易发生ATB-DILI,ESAT-6、CK-18和MMP-9升高与ATB-DILI严重程度有关。年龄>65岁、ESAT-6>31.3 pg/m L、CK-18>45.5 ng/m L是ATB-DILI的独立危险因素,联合检测高龄患者ESAT-6和CK-18表达水平,对预判及评估ATB-DILI严重程度具有较高的临床价值。

基因释放剂在制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板中的应用

目的 :探讨基因释放剂的应用并为结核病DNA疫苗的研究提供靶基因。方法 :分别用基因释放剂提取法与DNA提取试剂盒提取法制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板 ,采用PCR法从模板中扩增早期分泌性抗原靶 (ESAT - 6 )基因并测序证实所扩增的基因是否为目的基因。结果 :从基因释放剂提取法与DNA提取试剂盒提取法制备的DNA模板中均成功地扩增出了目的基因ESAT - 6。结论 :基因释放剂提取法制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板方便、快捷 ,提高了制备DNA模板效率。

ESAT-6 INF-γ和ADA在结核性脑膜炎早期诊断中的应用

目的探讨早期分泌性靶抗原-6（ESAT-6）、干扰素-γ（INF-γ）和腺苷脱氨酶（ADA）在结核性脑膜炎患儿早期诊断中的应用价值。方法采甩酶联免疫吸附试验（ELISA）检测EsAT-6和INF-γ水平，采用酶动力学终点法检测ADA水平，并将各组结果进行对比分析。结果结核性脑膜炎患儿急性期ESAT-6、INF-γ和ADA浓度均显著高于其恢复期水平和对照组（P〈0．05）。重症组ESAT-6、INF-γ和ADA浓度均显著高于轻症组，轻症组明显高于对照组（P〈0．05）。单项检测阳性率较低，三项联合检测能提高阳性检出率。结论ESAT-6、INF-γ和ADA对结核性脑膜炎患儿早期诊断具有重要的临床价值，三者联合检测能减少漏诊。

超滤浓缩脑脊液ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨离心超滤技术浓缩脑脊液检查结核杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)在诊断结核性脑膜炎(TBM)中的价值。方法选取TBM患者40例(TBM组)和非TBM患者20例(非TBM组),每位患者留取2份脑脊液(一份为原液,另一份为离心超滤浓缩),使用ELlSA法检测其ESAT-6水平。结果 TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05),而非TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性与原液比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用离心超滤浓缩技术能提高脑脊液ESAT-6检查的敏感性,且操作简单,可作为快速诊断TBM的参照指标。

结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定

目的 用 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白 (ESAT - 6 )基因构建真核表达重组质粒pcDNA3 1(+) -ESAT - 6 ,并鉴定其在真核细胞 (COS - 7)中的蛋白表达。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体pUCm -T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR反应产物克隆于真核表达载体 pcDNA3 1(+)上。并用脂质体介导真核表达重组质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT - 6转染真核细胞COS - 7,72h后 ,通过SDS -PAGE和免疫印迹鉴定ESAT - 6基因表达的蛋白。结果 用结核杆菌基因ESAT - 6构建重组真核表达质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT-成功 ,通过SDS -PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量 6kDa的特异蛋白 ,免疫印迹证明该 6kDa蛋白能与抗ESAT - 6单克隆抗体反应。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒成功构建 ,该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6。

脑脊液ESAT-6、ADA、INF-γ、MMP-9检测在结核性脑膜炎诊断及转归中的应用价值

目的探讨脑脊液分泌性靶抗原6(ESAT-6)、腺苷脱氨酶(ADA)、干扰素γ(INF-γ)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)检测在结核性脑膜炎(TBM)诊断及转归中的应用价值。方法回顾性分析185例TBM患者(TBM组)的临床资料,其中病情为轻症106例、重症79例,预后良好105例、不良80例,复发62例;同时,以96例进行脑脊液检查的非中枢系统疾病患者作为对照组。常规取脑脊液,ELISA法检测ESAT-6、INF-γ和MMP-9,酶动力学终点法检测ADA,分析各指标与TBM诊断及转归的关系。结果 TBM组脑脊液ESAT-6、ADA、INF-γ、MMP-9水平高于对照组(P均<0.05),并且重症者高于轻症者(P均<0.05)。四项指标联合检测诊断TBM的曲线下面积为0.829,高于各个指标单独检测(Z=8.126、9.113、7.596、0.138,P均<0.001),其敏感性为85.95%、特异性为88.54%。TBM患者预后良好者脑脊液MMP-9、INF-γ、ADA和ESAT-6水平均高于预后不良者(P均<0.05);复发者脑脊液ESAT-6、ADA、INF-γ和MMP-9水平高于未复发者(P均<0.05)。结论 TBM患者脑脊液ESAT-6、ADA、INF-γ和MMP-9水平升高,联合检测可提高TBM的诊断效率,并且其水平变化有助于患者预后和复发的判断。

脑脊液单核细胞内ESAT-6检测对结核性脑膜炎的诊断意义

目的评价检测脑脊液中单核细胞内的早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)对结核性脑膜炎诊断的意义,为结核性脑膜炎的诊断提供有效的方法。方法将20例结核性脑膜炎患者与20例对照组患者进行脑脊液常规、生化、细胞学检查,同时用免疫组化的方法检测脑脊液单核细胞内的ESAT-6及PPD。结果结核性脑膜炎患者单核细胞内存在ESAT-6,在20例结核性脑膜炎患者中14例显示阳性,对照组中1例阳性,结核性脑膜炎组单核细胞内ESAT-6阳性检出率显著高于对照组,(P<0.05),该方法诊断结核性脑膜炎敏感性为70%,特异性为95%,约登指数0.65。结核性脑膜炎组单核细胞内PPD阳性检出率显著高于对照组,(P<0.05),敏感性为0.65,特异性为0.90,约登指数为0.55。结论检测脑脊液单核细胞中ESAT-6是诊断结核性脑膜炎的一种简便、特异的方法 。

结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶-6和滤液培养蛋白10及脂阿拉伯甘露聚糖联合检测对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶-6(ESAT-6)、滤液培养蛋白10(CFP-10)和脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)联合检测对结核性脑膜炎的诊断价值。方法选取2013年1月至2015年12月在台州市第一人民医院住院的结核性脑膜炎36例(结脑组)和病毒性脑膜炎30例(非结脑组)为研究对象,用常规和生化方法检测脑脊液的细胞计数、葡萄糖、蛋白质和氯化物,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑脊液中ESAT-6、CFP-10和LAM浓度,并用SPSS 14.0软件对两组数据进行t检验。结果结脑组脑脊液细胞计数和蛋白质浓度明显高于非结脑组,差异有统计学意义(t值分别为11.38、9.62,P<0.05),葡萄糖和氯化物浓度明显低于非结脑组,差异均有统计学意义(t值分别为-6.90、-11.92,P<0.05);结脑组ESAT-6、CFP-10和LAM浓度[分别为(36.50±9.14)pg/ml、(298.71±31.56)pg/ml、(8.62±2.35)mg/ml]明显高于非结脑组[分别为(7.84±0.86)pg/ml、(35.32±11.80)pg/ml、(5.13±1.74)mg/ml],差异均有统计学意义(P<0.05);ESAT-6、CFP-10、LAM检测阳性率偏低,联合检测能提高诊断效能,其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和约登指数分别为88.89%、93.33%、94.12%、87.50%和0.822 2。结论脑脊液中ESAT-6、CFP-10和LAM联合检测对结核性脑膜炎的早期诊断具有一定的实用价值。

脑脊液单核细胞内ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值

目的通过检测结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)患者脑脊液单核细胞中的早期分泌抗原靶蛋白6(early secreted antigenic target,ESAT-6),探讨ESAT-6在TBM诊断中的价值。方法将42例TBM患者与47例对照组患者进行脑脊液生化、细胞学、抗酸染色检查,同时用免疫荧光细胞化学染色法检测脑脊液单核细胞内的ESAT-6。结果在临床诊断TBM的42例患者中有38例脑脊液单核细胞中检出ESAT-6,47例对照组中检出4例。TBM组ESAT-6的检出率明显高于对照组(P<0.05)。该方法诊断TBM的敏感性为90.48%,特异性为91.49%。约登指数达到0.82。结论检测脑脊液单核细胞内结核特异性抗原ESAT-6用于诊断TBM,具有灵敏度、特异度高的特点,而且简单易行,有望成为诊断TBM的一种新的辅助方法。

ESAT-6和干扰素-γ表达水平在结核性脑膜炎诊断中的应用价值

目的探讨脑脊液早期分泌性靶抗原-6(ESAT-6)和干扰素-γ(IFN-γ)表达水平变化在结核性脑膜炎的临床诊断中的应用价值。方法将2012-05~2016-05延安大学附属医院收治的90例结核性脑膜炎患者为观察组,选择同期住院的90例非结核性脑膜炎患者为对照组。采用ELISA法检测两组患者的脑脊液中的ESAT-6和IFN-γ水平,对观察组按照不同时相(急性期与恢复期)、不同病情程度(重症和轻症)分组进行ESAT-6、IFN-γ水平比较,并比较ESAT-6和IFN-γ单独与联合检测的灵敏性、特异性和阳性结果准确性。结果 1观察组结核性脑膜炎患者急性期的ESAT-6和IFN-γ水平均较对照组明显升高(P<0.05);而观察组结核性脑膜炎患者恢复期的ESAT-6和IFN-γ水平和对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。2观察组重症结核性脑膜炎患者的ESAT-6和IFN-γ水平均较轻症组和对照组明显升高(P<0.05);观察组轻症结核性脑膜炎患者的ESAT-6和IFN-γ水平均较对照组明显升高(P<0.05)。3ESAT-6和IFN-γ联合检测的灵敏性、特异性和阳性结果准确性均较单独ESAT-6、单独IFN-γ检测明显提高(P<0.05)。结论脑脊液ESAT-6和IFN-γ表达水平变化将有助于结核性脑膜炎的早期临床诊断。

ESAT-6诱导的外周血单个核细胞γ-干扰素反应对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨6-kDa早期分泌靶抗原（ESAT-6）刺激的外周血单个核细胞（PBMC）γ-干扰素（IFN-γ）反应对结核性脑膜炎的诊断价值。方法研究对象共82例，其中结核性脑膜炎组20例，病毒性脑膜炎组25例，一般细菌性脑膜炎组17例，并设健康对照组20例。Ficoll法分离PBMC并培养，分别以ESAT-6、纯化结核菌素（PPD）、植物血凝素（PHA）和生理盐水处理。ELISA法测定各组上清IFN-γ浓度。结果ESAT-6处理引起结核性脑膜炎组显著的IFN-γ反应（与生理盐水处理相比P〈0．01）。PPD刺激在结核性脑膜炎组亦均引起IFN-γ升高反应（与生理盐水处理相比P〈0．01），但程度低于ESAT-6处理，差异有统计学意义（P〈0．01）。ROC曲线分析显示，ESAT-6处理曲线下面积为0．918（P〈0．01），95％C10．831～1．0；PPD处理曲线下面积为0．725（P〈0．05），95％C10．56～0．89。结论ESAT-6诱导的PBMCIFN-γ反应对结核性脑膜炎的诊断具有良好的敏感度和特异度，且具有较高的临床易行性。

结核分枝杆菌19kD-ESAT6融合蛋白的克隆表达及纯化

运用聚合酶链反应(PCR)技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv中扩增获得19kD脂蛋白和esat-6基因片段,将目的片段分别克隆到pMD18-T载体,再亚克隆目的片段到同一表达载体pET-21a,构建重组表达载体pET21a-19kD-ESAT6,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),表达纯化后用蛋白质印迹法(Western blot)分析其抗原反应性。结果成功构建了重组质粒pET21a-19kD-ESAT6,并在大肠埃希菌中获得高效表达。SDS-PAGE结果显示,在相对分子质量(Mr)约29×103处有表达条带。Western blot结果表明,重组蛋白19kD-ESAT6与确诊的结核病患者血清发生特异性免疫反应,具有特异的抗原性。本研究构建的结核分枝杆菌19kD-ESAT6融合蛋白为结核病血清学诊断试剂的开发提供了依据。

结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达

目的 探讨结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT -6基因真核表达重组质粒在真核细胞 (COS -7)中的表达。 方法 用LipofectAMINETM2 0 0 0介导真核表达重组质粒 pcDNA3 .1(+ ) -ESAT -6转染真核细胞COS -7,72h后 ,通过RT -PCR和WesternBlotting试验鉴定ESAT -6基因在COS -7中的表达。 结果 通过RT -PCR从转染了pcDNA3 .1(+ ) -ESAT -6的COS -7中检测到目的基因mRNA的转录 ;WesternBlotting试验鉴定在转染pcDNA3 .1(+ ) -ESAT -6的COS -7的细胞裂解上清液中有ESAT -6基因的表达蛋白。 结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT -6真核表达重组质粒能够在真核细胞COS -7中表达ESAT -6蛋白 ,为进一步研究其特性及为结核病的诊断。

结核分枝杆菌特异性分泌抗原克隆和融合表达及抗原性鉴定

目的融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10,研究其免疫学特性,为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(+)中,构建pET32c(+)-linker。PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因。将CFP10克隆入改建的载体pET32c(+)的linker前,ESAT-6克隆入linker后,构建CFP10-ESAT-6融合基因;或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(+)linker前,CFP10克隆入linker后,构建ESAT-6-CFP10融合基因,分别转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠肝菌BL21中表达,通过Westernblot分析其抗原性。结果二个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c(+)的linker前或后。重组质粒pET32c(+)-CFP10-ESAT-6或pET32c(+)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在BL21菌中高效表达。Westernblot分析表明,融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒;pET32c(+)-CFP10-ESAT-6或pET32c(+)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白,该蛋白兼具CFP10和ESAT-6二种蛋白的抗原性。本研究为rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断的中应用奠定了基础。