脑脊液改良抗酸染色联合单核细胞内早期分泌抗原靶-6测定用于结核性脑膜炎早期诊断的研究

目的探寻结核性脑膜炎（TBM）早期诊断的新方法。方法选取徐州医科大学附属医院神经内科2013年5月-2015年2月收治的TBM患者38例及其他中枢神经系统感染患者38例。所有病例入院后24-48h内，腰椎穿刺脑脊液（CSF）并予常规检测，同时采用传统集菌法涂片抗酸染色检测结核分枝杆菌（MTB）、改良抗酸染色检测MTB、免疫细胞化学染色及酶联免疫吸附法（ELISA）测定早期分泌抗原靶-6（ESAT-6）。结果①改良抗酸染色检测MTB的灵敏度（Se）达71．1％，与传统抗酸染色（Se为2．6％）比较，差异有统计学意义（P=0．000）；改良抗酸染色图片中，单核细胞、中性粒细胞内见到MTB，同时淋巴细胞内也发现MTB；在同一样本中，MTB以短棒状、点状、球形及细长弯曲型等多种形态存在。②免疫细胞化学染色诊断TBM的Se为84．2％，Sp为89．5％；单核细胞表达ESAT-6最为常见，中性粒细胞、淋巴细胞内也存在ESAT-6表达现象。③CSF改良抗酸染色联合免疫细胞化学ESAT-6检测诊断TBM的Se为89．5％，与改良抗酸染色比较，差异有统计学意义（P=0．044）；联合检测的Sp为89．5％，与免疫细胞化学染色比较差异无统计学意义（P=0．169）。结论CSF改良抗酸染色联合单核细胞内ESAT-6测定可以提高诊断TBM的灵敏度。

脑脊液早期分泌性靶抗原-6水平的动态变化及对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨脑脊液早期分泌性靶抗原-6(ESAT-6)水平的动态变化对结核性脑膜炎早期诊断的意义。方法结脑病人50例,其中确诊者10例,临床诊断40例,非结核病对照40例,健康对照10例。间接酶联免疫吸附试验检测各组ESAT-6水平。结果间接ELISA方法检测脑脊液中的ESAT-6,敏感性88%,特异性92%,结脑组早期脑脊液ESAT-6含量较对照组明显升高,抗痨治疗6 w后脑脊液ESAT-6含量明显下降。结论应用间接酶联免疫吸附试验测定脑脊液中ESAT-6水平诊断结脑是可靠的,其动态变化有助于判断结脑预后。

ESAT-6 INF-γ和ADA在结核性脑膜炎早期诊断中的应用

目的探讨早期分泌性靶抗原-6（ESAT-6）、干扰素-γ（INF-γ）和腺苷脱氨酶（ADA）在结核性脑膜炎患儿早期诊断中的应用价值。方法采甩酶联免疫吸附试验（ELISA）检测EsAT-6和INF-γ水平，采用酶动力学终点法检测ADA水平，并将各组结果进行对比分析。结果结核性脑膜炎患儿急性期ESAT-6、INF-γ和ADA浓度均显著高于其恢复期水平和对照组（P〈0．05）。重症组ESAT-6、INF-γ和ADA浓度均显著高于轻症组，轻症组明显高于对照组（P〈0．05）。单项检测阳性率较低，三项联合检测能提高阳性检出率。结论ESAT-6、INF-γ和ADA对结核性脑膜炎患儿早期诊断具有重要的临床价值，三者联合检测能减少漏诊。

ESAT-6和干扰素-γ表达水平在结核性脑膜炎诊断中的应用价值

目的探讨脑脊液早期分泌性靶抗原-6(ESAT-6)和干扰素-γ(IFN-γ)表达水平变化在结核性脑膜炎的临床诊断中的应用价值。方法将2012-05~2016-05延安大学附属医院收治的90例结核性脑膜炎患者为观察组,选择同期住院的90例非结核性脑膜炎患者为对照组。采用ELISA法检测两组患者的脑脊液中的ESAT-6和IFN-γ水平,对观察组按照不同时相(急性期与恢复期)、不同病情程度(重症和轻症)分组进行ESAT-6、IFN-γ水平比较,并比较ESAT-6和IFN-γ单独与联合检测的灵敏性、特异性和阳性结果准确性。结果 1观察组结核性脑膜炎患者急性期的ESAT-6和IFN-γ水平均较对照组明显升高(P<0.05);而观察组结核性脑膜炎患者恢复期的ESAT-6和IFN-γ水平和对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。2观察组重症结核性脑膜炎患者的ESAT-6和IFN-γ水平均较轻症组和对照组明显升高(P<0.05);观察组轻症结核性脑膜炎患者的ESAT-6和IFN-γ水平均较对照组明显升高(P<0.05)。3ESAT-6和IFN-γ联合检测的灵敏性、特异性和阳性结果准确性均较单独ESAT-6、单独IFN-γ检测明显提高(P<0.05)。结论脑脊液ESAT-6和IFN-γ表达水平变化将有助于结核性脑膜炎的早期临床诊断。

超滤浓缩脑脊液ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨离心超滤技术浓缩脑脊液检查结核杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)在诊断结核性脑膜炎(TBM)中的价值。方法选取TBM患者40例(TBM组)和非TBM患者20例(非TBM组),每位患者留取2份脑脊液(一份为原液,另一份为离心超滤浓缩),使用ELlSA法检测其ESAT-6水平。结果 TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05),而非TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性与原液比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用离心超滤浓缩技术能提高脑脊液ESAT-6检查的敏感性,且操作简单,可作为快速诊断TBM的参照指标。

近红外荧光标记-免疫磁珠偶联法定量检测结核分枝杆菌ESAT-6蛋白

目的建立定量检测结核分枝杆菌早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)的近红外荧光标记-免疫磁珠偶联法。方法以近红外荧光染料(Dylight 800)标记靶向ESAT-6的单克隆抗体,靶向ESAT-6的多克隆抗体包被在纳米磁珠表面。采用双抗体夹心法,磁性分离结合物和游离物,采用便携式高灵敏度低噪声激发式荧光检测仪检测磁性结合物的荧光强度,从而检测待检样品中ESAT-6水平。结果该方法的检测线性范围为2.4~750.0ng/mL,最低检测限为0.48ng/mL;10ng/mL水平加样回收率为96%,50ng/mL水平加样回收率为95%;批间变异系数(CV)为5.8%,批内CV为4.3%。该方法检测胸腔积液标本ESAT-6的特异度为80%,灵敏度为95%。结论该方法检测ESAT-6的线性范围广、灵敏度高、稳定性好。

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达及纯化研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达系统,建立表达及纯化方法,为其应用打下基础。方法根据ESAT-6的基因序列设计引物,从结核菌基因组DNA中扩增基因,酶切后插入表达载体,测序证实后转入大肠杆菌JM109菌株,经IPTG诱导表达,产物经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶法纯化。结果ESAT基因产物大小、酶切片断大小和载体的大小与设计一致、ESAT-6基因测序的结果与目的基因完全符合。表达纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。结论构建结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达载体成功,纯化出目的蛋白。

结核性脑膜炎患者治疗前后ESAT-6、IL-10及PCT水平变化及临床意义探讨

目的探究与分析结核性脑膜炎患者治疗前后早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)、白细胞介素-10(IL-10)及降钙素原(PCT)的水平变化及临床意义。方法选取56例结核性脑膜炎患者作为结核组,51例病毒性脑膜炎患者作为病毒组,48例化脓性脑膜炎患者作为化脓组。三组患者均给予药物治疗+对症支持治疗。对比三组患者治疗前后脑脊液中、血清中的ESAT-6、IL-10及PCT的水平变化。结果治疗前,结核组脑脊液中ESAT-6水平高于化脓组,IL-10、PCT水平均低于化脓组,差异具有统计学意义(P<0.05);结核组脑脊液中ESAT-6、IL-10水平均高于病毒组,差异具有统计学意义(P<0.05);病毒组脑脊液中IL-10、PCT水平均低于化脓组,差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗后,结核组脑脊液中ESAT-6、IL-10及PCT水平分别为(7.43±1.83)IU/ml、(14.40±1.74)pg/ml、(0.45±0.09)mg/L,均低于治疗前的(27.61±2.35)IU/ml、(30.87±3.41)pg/ml、(0.84±0.13)mg/L,差异具有统计学意义(P<0.05);化脓组脑脊液中ESAT-6、IL-10及PCT水平分别为(0.36±0.17)IU/ml、(20.35±2.40)pg/ml、(1.21±0.31)mg/L,均低于治疗前的(1.89±0.15)IU/ml、(40.71±5.23)pg/ml、(2.03±0.26)mg/L,差异具有统计学意义(P<0.05);病毒组脑脊液中ESAT-6、IL-10及PCT水平分别为(0.44±0.09)IU/ml、(11.84±1.67)pg/ml、(0.41±0.07)mg/L,均低于治疗前的(1.95±0.15)IU/ml、(22.59±1.85)pg/ml、(0.85±0.14)mg/L,差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗前,结核组血清中ESAT-6、PCT水平均高于化脓组,IL-10水平低于化脓组,差异具有统计学意义(P<0.05);结核组血清中ESAT-6、PCT水平均高于病毒组,差异具有统计学意义(P<0.05);病毒组血清中IL-10水平低于化脓组,差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗后,结核组血清中ESAT-6、IL-10及PCT水平分别为(0.76±0.13)IU/ml、(43.50±6.12)pg/ml、(0.19±0.06)mg/L,均低于治疗前的(1.12±0.21)IU/ml、(57.39±8.23)pg/ml、(0.34±0.18)mg/L,差异具有统计学意义(P<0.05);化脓组血清中ESAT-6、IL-10及PCT水平分别为(0.62±0.31)IU/ml、(45.21±2.29)pg/ml、(0.07±0.02)mg/L,均低于治疗前的(0.83±0.29)IU/ml、(90.67±6.12)pg/ml、(0.18±0.07)mg/L,差异具有统计学意义(P<0.05);病毒组血清中ESAT-6、IL-10及PCT水平分别为(0.60±0.17)IU/ml、(42.98±8.74)pg/ml、(0.08±0.02)mg/L,均低于治疗前的(0.79±0.18)IU/ml、(52.33±7.29)pg/ml、(0.19±0.05)mg/L,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论ESAT-6、IL-10及PCT的水平变化有助于结核性脑膜炎病情的判断,同时可用于病毒性脑膜炎及化脓性脑膜炎这两类疾病的区分。

脑脊液单核细胞早期分泌性抗原靶-6联合脑脊液阿拉伯糖甘露糖脂抗体对结核性脑膜炎的诊断价值研究

目的探讨脑脊液单核细胞早期分泌性抗原靶-6(ESAT-6)联合脑脊液阿拉伯糖甘露糖脂(LAM)抗体对结核性脑膜炎的诊断价值。方法选择2010年1月—2014年8月在新乡医学院第一附属医院住院的结核性脑膜炎患者49例作为结核性脑膜炎组,化脓性脑膜炎患者28例作为化脓性脑膜炎组,病毒性脑膜炎患者24例作为病毒性脑膜炎组,同期体检健康者60例作为正常对照组。各组受检者均进行脑脊液细胞学检查和生化检查,脑脊液单核细胞ESAT-6及LAM抗体检测,并通过绘制ROC曲线评价脑脊液单核细胞ESAT-6、脑脊液LAM抗体及二者联合(并联试验)对结核性脑膜炎的诊断效能。结果 4组受检者脑脊液白细胞计数、中性粒细胞分数、淋巴细胞分数及单核细胞分数比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。4组受检者脑脊液蛋白含量、糖含量、氯化物含量比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。脑脊液单核细胞ESAT-6诊断结核性脑膜炎的曲线下面积(AUC)为0.876〔95%CI(0.764,0.910)〕,取最佳临界值时灵敏度为89.80%、特异度为96.43%;脑脊液LAM抗体诊断结核性脑膜炎的AUC为0.852〔95%CI(0.560,0.890)〕,取最佳临界值时灵敏度为55.10%、特异度为100.00%;两者联合诊断结核性脑膜炎的AUC为0.924〔95%CI(0.850,1.000)〕,取最佳临界值时灵敏度为92.00%、特异度为97.30%。结论脑脊液单核细胞ESAT-6联合脑脊液LAM抗体对结核性脑膜炎的诊断效能较高,有助于提高诊断结核性脑膜炎的灵敏度。

结核性脑膜炎患者早期分泌性抗原-6和特异度抗原培养滤液蛋白-10水平变化及意义

目的监测结核性脑膜炎(TBM)患者结核分枝杆菌早期分泌性抗原-6(ESAT-6)和特异度抗原培养滤液蛋白-10(CFP-10)的动态变化并评估其临床意义。方法收集2013年1月-2016年12月在台州市第一人民医院治疗的结核性脑膜炎患者39例(TBM组)和非结核性脑膜炎53例(对照组)。同时,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑脊液中ESAT-6和CFP-10水平。结果 TBM组患者ESAT-6、CFP-10水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。ESAT-6诊断TBM的灵敏度、特异度和ROC曲线下面积(AUC)分别为79.5%、90.6%、0.922。CFP-10诊断TBM的灵敏度、特异度和AUC分别为87.2%、86.8%、0.894。随着疾病的进展,TBM患者ESAT-6、CFP-10水平逐渐下降,且治疗3个月后,TBM组患者ESAT-6、CFP-10水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ESAT-6和CFP-10可以作为结核性脑膜炎的快速、准确的诊断指标。

人乳头瘤病毒58型截短型L1蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6的融合表达及其抗血清的制备

目的原核表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型截短型L1(Truncated L1,tL1)蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6(Early secreted antigenic target-6,ESAT-6)融合蛋白,并制备其抗血清。方法利用PCR技术分别从HPV基因组DNA和ESAT-6-18T质粒DNA中扩增tL1和ESAT-6基因,构建重组原核表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a,分别转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白ESAT-6-tL1经镍离子亲和层析柱纯化后免疫昆明小鼠,ELISA检测血清抗体效价。结果 PCR扩增出750 bp的tL1基因片段和320 bp的ESAT-6基因片段,测序结果与GenBank登录的序列一致;重组表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a经双酶切鉴定,构建正确;表达的ESAT-6-tL1融合蛋白相对分子质量约40 000,在E.coli Rosetta中的表达形式为包涵体,纯化后纯度为85%,免疫小鼠血清抗体效价为1:4 000。结论成功表达了ESAT-6-tL1融合蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研制检测HPV58的抗体奠定了基础。

ESAT-6、IL-8和INF-γ在结核性脑膜炎早期诊断中的应用

目的探讨早期分泌性靶抗原-6(ESAT-6)、白细胞介素-8(IL-8)和干扰素-γ(INF-γ)在结核性脑膜炎早期诊断中的应用价值。方法选取2009年6月-2013年5月间在本院住院的结核性脑膜炎患儿57例,非中枢神经系统感染性疾病患儿30例,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ESAT-6、IL-8和INF-γ的水平,并将各项指标进行对比分析。结果结核性脑膜炎组EAST-6、IL-8和INF-γ三项浓度显著高于其恢复期水平,也显著高于对照组水平(P<0.01),结核性脑膜炎组恢复期三项浓度与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。单独检测其中一项,灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值较低,三项指标联合检测能使其达到最大值。结论检测脑脊液中EAST-6、IL-8和INF-γ浓度有助于结核性脑膜炎的早期诊断,其浓度动态变化有助于疗效观察和判断预后。

脑脊液检测指标在感染性脑膜炎诊断中的应用

中枢神经系统感染性疾病尤其是各类脑膜炎为临床常见病,病死率和致残率高。近年来由于抗生素的广泛应用,该类疾病临床表现缺乏特异性,脑脊液改变不典型,为其早期诊断和鉴别诊断带来困难。中枢神经系统感染性脑膜炎的诊断指标越来越丰富,如胱抑素C、降钙素原对化脓性脑膜炎的诊断,S-100B对病毒性脑膜炎的诊断,脱氨酶、早期分泌抗原靶-6、干扰素对结核性脑膜炎的诊断。但各个指标均有一定的诊断灵敏度和特异性,临床实际应用中可采用多项指标联合检测,以便更准确地用于疾病的诊断、鉴别诊断和治疗监测。

结核感染T细胞斑点试验在鉴别结核性与恶性胸腔积液中的价值研究

目的:探究结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)在鉴别结核性和恶性胸腔积液中的价值。方法:选取胸腔积液患者407例为研究对象,分为结核性胸腔积液组(328例)和恶性肿瘤胸腔积液组(79例)。比较两组患者胸腔积液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB检测结果及胸腔积液与外周血T-SPOT.TB差值。通过受试者工作特征曲线(ROC)分析胸腔积液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB及胸腔积液与外周血T-SPOT.TB差值对结核性和恶性肿瘤胸腔积液的鉴别诊断效能。结果:结核性胸腔积液组胸腔积液中早期分泌抗原靶蛋白-6(ESAT-6)、培养滤液蛋白-10(CFP-10)及ESAT-6+CFP-10斑点形成细胞(SFC)数量高于恶性肿瘤胸腔积液组(均P<0.05)。结核性胸腔积液组外周血中ESAT-6、CFP-10及ESAT-6+CFP-10 SFC数量高于恶性肿瘤胸腔积液组(均P<0.05)。结核性胸腔积液组胸腔积液ESAT-6+CFP-10与外周血ESAT-6+CFP-10 SFC数量差值高于恶性肿瘤胸腔积液组(P<0.05)。ROC曲线分析显示,胸腔积液T-SPOT.TB检测结果曲线下面积(AUC)高于外周血T-SPOT.TB。结论:胸腔积液较外周血T-SPOT.TB对结核性胸腔积液的辅助诊断价值更高。胸腔积液T-SPOT.TB与外周血T-SPOT.TB检测结果差值对鉴别结核性胸膜积液和恶性胸腔积液有较高辅助诊断价值。

结核分枝杆菌模拟抗原的筛选及初步应用

目的通过对早期分泌抗原-6(ESAT-6)及培养基滤过蛋白-10(CFP-10)肽库的结核分枝杆菌模拟抗原的筛选,旨在建立一个临床鉴别诊断结核分枝杆菌感染的新方法。方法基于蛋白ESAT-6和CFP-10的序列,随机设计合成一组19肽库,通过γ-干扰素释放试验筛选特异性结核分枝杆菌抗原模拟多肽,并研究确立其工作浓度。结果经过多轮筛选获得3条特异性模拟多肽,分别是P1MG、P8NV、P11LD,灵敏度分别为93.3%、90.0%、80.0%,特异性均>90.0%;工作浓度均为2μg/ml;将3种模拟多肽等浓度混合作为刺激原,初步临床验证试验表明,其灵敏度为95.3%,特异性为96.2%。结论基于蛋白ESAT-6和CFP-10的序列设计、筛选、制备的混合型模拟多肽抗原,有望建立一种临床结核分枝杆菌鉴别诊断的新方法。