西方蜜蜂AmAGO1蛋白的分子特性、时空表达谱及抗体制备

【目的】Argonaute(AGO)家族是一类在进化上高度保守的蛋白家族,其在真核生物中主要参与形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),进而通过沉默基因表达参与诸多生物学过程。蜜蜂AGO蛋白的相关研究迄今仍然缺失。本研究拟通过预测西方蜜蜂Apis mellifera的AGO1(AmAGO1)理化性质和分子特性,解析AmAGO1在西方蜜蜂中的时空表达谱,并制备AmAGO1的多克隆抗体,为深入开展AmAGO1的功能与机制研究提供参考和基础。【方法】PCR扩增西方蜜蜂AmAGO1的编码序列(coding sequence,CDS);通过生物信息学预测AmAGO1蛋白的理化性质和分子特性;利用RT-qPCR检测AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、3日龄幼虫、7日龄预蛹、8日龄预蛹、12日龄蛹以及1,2,6,12,15和18日龄成虫以及工蜂成虫触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺中的表达量;构建原核表达质粒后诱导表达AmAGO1融合蛋白,并鉴定其表达形式;制备AmAGO1多克隆抗体,利用ELISA,Western blot和免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)分别检测抗体效价、灵敏度和特异性。【结果】成功克隆到西方蜜蜂AmAGO1的CDS;AmAGO1含928个氨基酸,分子式为C4624H7332N1316O1325S51,分子量约为104.2 kD,等电点为9.31,平均亲水系数为-0.2965,含86个磷酸化位点及典型的PAZ结构域和PIWI结构域,但不存在典型的信号肽;AGO1在智人Homo sapiens、斑马鱼Danio rerio、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori、西方蜜蜂、东方蜜蜂A.cerana和欧洲熊蜂Bombus terrestris中具有较高的氨基酸序列一致性;西方蜜蜂和东方蜜蜂的AGO1聚为一支,同源性最高。AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫中均有表达但表达量存在差异,3日龄幼虫和7日龄预蛹中AmAGO1的表达量显著低于卵中的表达量,而8日龄预蛹和12日龄蛹中AmAGO1的表达量显著高于卵中的表达量;AmAGO1在1,2,6,12,15和18日龄工蜂体内均有表达但表达量也存在差异,其中1日龄成虫体内AmAGO1的表达量显著高于其他日龄成虫体内的表达量;AmAGO1在工蜂成虫触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在差异,触角中AmAGO1的表达量与咽下腺中的相差无几,但二者均显著高于毒腺、脑、中肠、脂肪体和表皮中AmAGO1的表达量;AmAGO1融合蛋白的表达形式为包涵体;制备的AmAGO1多克隆抗体具有较高的效价、灵敏度和特异性。【结论】AmAGO1可能是亲水性胞内蛋白,含有典型的PAZ结构域和PIWI结构域;AmAGO1在西方蜜蜂工蜂不同组织和不同发育阶段发挥潜在的重要功能;成功制备出高效价、高灵敏度和强特异性的AGO1多克隆抗体。

二化螟Halloween家族基因Cyp302a1和Cyp315a1的克隆与时空表达谱分析

[目的]Halloween家族基因参与合成蜕皮激素,调控昆虫发育、繁殖等重要生命过程。二化螟(Chilo suppressalis)是水稻的重要害虫,明确二化螟Halloween家族基因完整序列及表达谱特征,对后续开展二化螟生长发育等调控机制研究具有重要作用。[方法]利用反转录PCR(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆二化螟Halloween家族基因成员Cyp302a1和Cyp315a1的完整转录本序列;通过多重比对分析序列保守结构特征;利用MEGA 7.0软件构建了分子系统进化树;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析基因的时空表达谱。[结果]克隆获得二化螟Halloween家族2个基因CsCyp302a1和CsCyp315a1的全长cDNA序列。各基因均含有5个序列保守结构域:WxxxR(Helix-C)、GxE/DTT/S(Helix-I)、ExxR(Helix-K)、PxxFxPE/DRF(PERF motif)和PFxxGxRxCxG/A(heme-binding domain),并且与各自的基因家族成员聚为一支。各基因在不同发育时期和不同组织内的表达水平存在差异,其表达模式在不同基因间也存在差异。二化螟Cyp307a1相对表达量最高,Cyp315a1相对表达量最低。Cyp307a1在头部表达量高;Cyp306a1在中肠表达量高;Cyp302a1和Cyp315a1在头部和表皮中表达量高;Cyp314a1在脂肪体和表皮中表达量高。[结论]明确了二化螟Halloween家族2个基因序列特征和全部5个主要基因的时空表达谱特征。

伊蚊5-HT受体家族生物信息学分析和时空表达谱的构建

5-羟色胺(5-HT)可通过多个受体介导来调控昆虫的生长发育和运动等生理活动,也是新型杀虫剂潜在的靶点。本研究对埃及伊蚊的5-羟色胺受体家族进行系统分析,即利用生物信息学方法、进化分析5-HT受体在物种间的同源性,构建系统进化树;使用同源建模的方法以人类5-羟色胺受体结构为模板,构建埃及伊蚊(Aedes aegypti)5-HT受体的三维结构模型;通过实时荧光定量PCR方法研究受体在埃及伊蚊幼虫期、蛹期和成蚊,未吸血雌蚊的头、胸、腹及附肢的表达情况。从NCBI和VectorBase数据库中得到埃及伊蚊的6个5-HT受体基因,生物信息学分析发现6个受体结构均具有7次跨膜区,其中在受体蛋白的二级结构中α-螺旋占有较高的比重。进化分析结果表明,埃及伊蚊5-HT受体基因分别位于3个不同的分支,各分支均与黑腹果蝇5-HT相应受体具有较高的同源性。表达谱构建结果表明,相比各龄幼虫和雌蚊,5-HT受体均在雄蚊中的表达量最高,且在雌蚊各组织中呈现明显的差异。5-HTR1B、5-HTR2B、5-HTR7B在头、胸、腹和附肢4种组织中均有表达;5-HTR1A在头、胸、腹中均有表达;5-HTR1D在胸腔中高表达,但在头部和附肢中不表达;5-HTR7A在附肢中表达丰度最高,而在头部无表达;该结果预示不同受体介导5-HT的功能可能不同。本研究明确了埃及伊蚊5-HT受体家族蛋白的序列特征、进化关系及组织表达特征,为埃及伊蚊5-HT受体功能的进一步研究奠定了基础。

草地贪夜蛾海藻糖合成酶基因的克隆、时空表达谱及对温度胁迫的响应

【目的】本研究旨在通过克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase)基因SfTPS,分析其在草地贪夜蛾不同发育阶段、不同组织中的表达水平及不同温度胁迫时5龄幼虫中的相对表达量,为进一步探究TPS在草地贪夜蛾生长发育及抗逆应激反应中的功能奠定基础。【方法】运用RT-PCR技术克隆草地贪夜蛾SfTPS的全长编码区,并进行生物信息学分析。运用RT-qPCR技术检测SfTPS在草地贪夜蛾不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(体壁、中肠和脂肪体)中和经短期(2,4和8 h)高(35℃)低温(10℃)胁迫后5龄幼虫中的表达变化。【结果】克隆获得2571 bp的草地贪夜蛾TPS cDNA序列,命名为SfTPS(GenBank登录号:MT920672),全长开放阅读框(ORF)长2481 bp,编码的826个氨基酸具有TPS和TPP两个保守结构域。同源比对和系统进化分析表明,昆虫TPS蛋白具有较高的保守性,SfTPS与斜纹夜蛾S.litura的TPS亲缘关系最近,序列一致性达到99.15%。SfTPS中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲占比分别为38.14%,12.23%和48.55%;SfTPS的三级结构为同源二聚体。RT-qPCR结果表明,SfTPS在草地贪夜蛾卵期和1-5龄幼虫期低表达,在6龄幼虫期、蛹期和成虫期高表达,且草地贪夜蛾变态前后SfTPS的表达量变化较大。组织分布结果显示,SfTPS在5龄幼虫脂肪体中表达量最高。草地贪夜蛾5龄幼虫经2~8 h低温(10℃)和高温(35℃)胁迫后,SfTPS的相对表达量显著高于对照(25℃),分别为对照的4.43~9.34和2.50~6.03倍。【结论】SfTPS基因在草地贪夜蛾生长发育过程及抵御高低温度胁迫中可能具有重要作用。

麦二叉蚜唾液蛋白基因Sg1655时空表达谱及其抑制小麦防御反应的功能

为进一步明确麦二叉蚜Schizaphis graminum唾液蛋白Sg1655在调控小麦防御反应中的作用,基于麦二叉蚜唾液腺转录组数据,利用PCR技术克隆获取Sg1655开放阅读框,利用生物信息学软件对其序列进行分析;通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术检测Sg1655在麦二叉蚜不同组织及不同龄期中的表达;利用细菌III型分泌系统将Sg1655导入到小麦叶片内,检测其瞬时表达对小麦胼胝质积累的影响。结果表明,Sg1655开放阅读框全长375 bp,编码125个氨基酸残基,N端1~21位为信号肽序列,预测蛋白分子量为14.90 kD。麦二叉蚜Sg1655氨基酸序列与玉米蚜Rhopalosiphum maidis同源序列相致性最高,为89.52%;麦二叉蚜Sg1655与玉米蚜同源序列聚为一个分支,亲缘关系最近。Sg1655在麦二叉蚜各组织中均有表达,其中在唾液腺中表达量最高,Sg1655在麦二叉蚜各个龄期均有表达,且在不同龄期之间无显著差异。小麦叶片内Sg1655瞬时表达可显著抑制小麦胼胝质积累,表明该蛋白可作为潜在效应子参与抑制小麦防御反应。

棉铃虫c-Myc基因的原核表达纯化、抗体制备、时空表达谱测定与功能分析

细胞致瘤基因(cellular-myelocytomatosis viral oncogene,c-Myc)编码的c-Myc蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路调节相关基因的表达,近年来引起了广泛的研究关注。本研究旨在利用原核表达系统体外表达棉铃虫(Helicoverpa armigera)c-Myc(Ha-c-Myc)基因,制备多克隆抗体,明确Ha-c-Myc的时空表达模式,并探究Ha-c-Myc在调控棉铃虫胆固醇载体蛋白-2(sterol carrier protein-2,SCP-2)基因表达中的潜在作用。通过PCR扩增Ha-c-Myc基因并克隆至pET-32a(+)原核表达载体中,构建重组表达质粒pET-32a-Ha-c-Myc,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞,使用IPTG诱导蛋白表达,并通过Ni2+-NTA柱纯化重组蛋白,用重组蛋白免疫新西兰兔制备抗Ha-c-Myc多克隆抗体。利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)法检测棉铃虫不同发育时期(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)和预蛹期不同组织(中肠、脂肪体、头部和表皮)中Ha-c-Myc基因的表达水平。设计合成Ha-c-Myc siRNA并转染棉铃虫Ha细胞,通过qRT-PCR分析Ha-c-Myc基因的RNA干扰后棉铃虫Ha-c-Myc基因和HaSCP-2基因mRNA表达的情况。结果表明,本实验构建了pET-32a-Ha-c-Myc重组质粒,在大肠杆菌中获得了高效表达的、大小约为65 kDa的可溶性Ha-c-Myc蛋白。经纯化得到纯度较高的蛋白,免疫新西兰兔制备了多克隆抗体,免疫印迹实验(Western blotting)表明抗体的特异性较好,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析显示抗体具有较高的效价。qRT-PCR实验发现Ha-c-Myc基因在棉铃虫各发育阶段均有表达,在幼龄和大龄幼虫及预蛹中表达量较高,其中预蛹的表达量最高。组织表达结果显示,Ha-c-Myc基因在预蛹不同组织均有一定表达但存在差异,在中肠部位具有高表达,而在表皮和脂肪体表达水平较低。RNA干扰的结果显示,Ha-c-Myc表达的敲降对HaSCP-2基因的转录有较大影响,导致HaSCP-2基因的相对表达水平显著性降低了50%。上述研究表明,利用pET-32a(+)原核表达系统可以有效地表达可溶性Ha-c-Myc蛋白,并且制备高质量的抗Ha-c-Myc多克隆抗体。RNA干扰证明在中肠组织高表达的Ha-c-Myc能促进HaSCP-2基因的转录表达,在棉铃虫的脂质代谢中具有重要作用。本实验结果有助于深入研究Ha-c-Myc在棉铃虫中的潜在功能及其作用机理,为探究绿色农药的新型作用靶标提供实验数据。

家蚕模式识别受体PGRP、βGRP编码基因的克隆鉴定及表达谱分析

模式识别受体(PRR)是生物体先天免疫系统中免疫受体的代表,对生物体的生存极为重要。克隆鉴定了家蚕的14个模式识别受体编码基因,包括10个肽聚糖识别蛋白(PGRP)基因和4个β-葡聚糖识别蛋白(βGRP)基因,并得到了BmPGRP-S3、BmPGRP-S4和BmPGRP-L5的完整编码序列。家蚕PGRP的长型和短型亚家族都具有典型的酰胺酶活性结构域,短型亚家族具有信号肽,长型亚家族则没有信号肽。5个PGRP长型亚家族基因成簇分布于第1号染色体;5个PGRP短型亚家族基因中有2个分布于第9号染色体,有3个分布于第16号染色体。家蚕βGRP家族成员都具有信号肽,其中BmβGRP1-3成簇分布于第11号染色体,编码蛋白不具有典型的葡聚糖结合结构域;BmβGRP4独立分布于第22号染色体,编码蛋白具有典型的葡聚糖结合结构域。基因芯片数据分析表明,BmPGRP-L5和BmβGRP1在5龄第3天幼虫各组织中没有表达,其余12个模式识别受体基因为多组织表达,但在丝腺组织中均无表达。在这12个模式识别受体基因中,BmPGRP-L3等6个模式识别受体基因在中肠组织中的表达水平偏高;BmβGRP3、BmβGRP4和BmPGRP-L3、BmPGRP-L4等在家蚕生殖腺中的表达水平较高。在生殖腺以外的其他各组织中,这12个基因的表达不具有雌雄差异性。BmβGRP1在家蚕各发育时期没有表达,BmPGRP-L5主要在变态发育的转折期表达,其余12个模式识别受体基因在各发育时期均有表达,并从5龄第3天幼虫到上蔟第2天有较高水平的表达,雌雄个体间无表达差异性。由此说明这些模式识别受体基因的表达具有一定的组织性和发育时期性。给人工饲料无菌饲养的家蚕5龄第3天幼虫分别添食大肠杆菌、家蚕黑胸败血菌和家蚕白僵菌,对免疫诱导3、6、12和24h的家蚕进行个体水平的实时荧光定量PCR检测,发现PGRP长型亚家族基因BmPGRP-L1、BmPGRP-L3和短型亚家族基因BmPGRP-S1-3均能被这3种微生物诱导上调表达;βGRP基因家族中的BmβGRP3、BmβGRP4也能被3种微生物诱导上调表达。同时对诱导12h时家蚕各组织中14个家蚕模式识别受体基因的表达谱进行分析,结果显示经3种微生物分别诱导后,家蚕头部组织中BmβGRP2、BmβGRP4、BmPGRP-L2和BmPGRP-S1、BmPGRP-S3-5均上调表达;表皮、中肠和脂肪体中仅有BmβGRP3、BmPGRP-L4等少数模式识别受体基因上调表达。

四种鳞翅目害虫精氨酸激酶基因的表达谱及基于RNAi的功能分析

【目的】精氨酸激酶(arginine kinase,AK)(EC2.7.3.3)是昆虫体内重要的磷酸原激酶(能量代谢调节因子),也是唯一能够形成有效ATP的磷酰基供体,起着与脊椎动物中肌酸激酶相同的作用。本研究旨在了解鳞翅目害虫AK基因的表达和功能。【方法】利用qRT-PCR方法测定AK基因在大螟Sesamia inferens、二化螟Chilo suppressalis、甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜纹夜蛾Spodoptera litura这4种鳞翅目害虫不同发育阶段和3龄幼虫不同组织中的表达谱;通过终点法检测了这4种害虫不同发育阶段和幼虫不同组织中的AK酶活性;采用RNAi技术抑制该基因的表达并分析其功能。【结果】AK基因在大螟、二化螟、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾这4种鳞翅目昆虫的不同发育阶段和3龄幼虫不同组织中均有表达,说明该基因的表达不具有发育时期和组织特异性。不同发育时期和3龄幼虫不同组织中AK酶活性与基因表达量变化趋势大体一致。注射以AK基因为靶标的dsRNA6d后,4种害虫体内AK基因的mRNA表达下降30%~50%,AK酶活性降低30%左右;14d后幼虫的死亡率达50%左右,显著高于对照组幼虫的死亡率。【结论】AK基因在上述4种鳞翅目害虫中为组成型表达,RNAi抑制AK基因的表达可导致4种害虫的幼虫死亡,研究结果为开发以AK基因为靶标的鳞翅目害虫防治新技术提供了理论依据。

家蚕BmYki-1基因鉴定与表达特征

【目的】Hippo信号通路中的核心激酶通过磷酸化作用于转录共激活因子Yki来调控下游基因的表达,在控制器官大小、细胞增殖与凋亡等方面起关键作用。家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目模式昆虫,对其Hippo通路研究较少。论文旨在通过鉴定家蚕BmYki-1并对其序列信息和表达特征进行分析,为进一步研究中肠中Hippo信号通路提供基础,更好地了解Hippo信号通路在肠道稳态维持及组织损伤修复方面的调控机制。【方法】利用NCBI数据库及家蚕基因组数据库等相关信息,以哺乳动物和果蝇的Yki蛋白序列为依据,对家蚕Yki基因的同源序列进行鉴定;以家蚕大造品系为研究材料,利用PCR和c DNA末端快速克隆技术克隆获得家蚕BmYki两种可变剪切体的全长序列BmYki-1和BmYki-2,并基于生物信息学方法对两种剪切体的基因序列特征及蛋白结构特征进行分析;重点对BmYki-1在家蚕中肠组织中的功能进行探索;利用半定量PCR检测家蚕L5D3不同组织及中肠各个龄期BmYki-1表达情况;构建BmYki-1过表达载体并转染家蚕胚胎细胞系对其进行亚细胞定位分析;实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测用博来霉素损伤的家蚕中肠中BmYki-1的表达情况。【结果】家蚕中存在两种可变剪切形式的BmYki,分别为BmYki-1和BmYki-2,在家蚕基因组数据库中对应的注释号分别为BGIBMGA0082-TA和BGIBMGA0081-TA,其开放阅读框(ORF)分别为1 329和1 227 bp,分别编码442和408个氨基酸,其蛋白质分子量分别为48和44.1 k D,等电点分别为5.18和5.50,在139—171、220—252氨基酸处均各有1个WW结构域。多物种进化树表明,家蚕BmYki-1与同为鳞翅目的昆虫脐橙螟的亲缘关系最近,与鞘翅目、膜翅目昆虫较近,与双翅目昆虫较远,而与脊椎动物的亲缘关系最远。结果显示BmYki-1在家蚕中肠和丝腺中特异表达,中肠不同龄期表达谱分析结构显示表达量从2眠开始上调,在5龄的前中期表达水平较高。亚细胞定位试验表明BmYki-1蛋白在家蚕胚胎细胞系中主要存在于细胞核中,但在细胞质中也有分布。与对照相比,用博来霉素损伤的家蚕中肠中BmYki-1的表达量显著上调。【结论】获得了BmYki-1全长序列及时空表达特征,亚细胞定位BmYki-1蛋白主要在细胞核中,推测其在家蚕中肠细胞生长发育及损伤修复中起重要作用。

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP8的表达及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在解析小地老虎Agrotis ipsilon化学感受蛋白AipsCSP8的表达谱及配体结合特征。【方法】利用qRT-PCR方法测定了AipsCSP8在小地老虎成虫头、胸、腹、足、翅、性腺(附腺)、触角、喙和下唇须以及雌雄虫羽化前后触角中的表达水平。体外重组表达AipsCSP8蛋白,通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白AipsCSP8对24种性信息素、22种植物挥发物和10种化学农药的结合特性。【结果】qRT-PCR检测结果显示,AipsCSP8在小地老虎雄成虫的足和下唇须中表达量最高,在附腺和触角中的表达量次之;在雌成虫的触角中表达量最高,在足、性腺、下唇须中的表达量次之。另外,雄、雌虫触角中AipsCSP8表达量分别在成虫羽化前1 d和羽化当天达到顶峰。荧光竞争结合实验结果表明,重组蛋白AipsCSP8对植物挥发物邻苯二甲酸二丁酯(解离常数Ki=14.6μmol/L)、苯乙醛(Ki=17.2μmol/L)以及化学农药阿维菌素(Ki=12.9μmol/L)均有较强的结合能力。【结论】化学感受蛋白AipsCSP8可能参与小地老虎嗅觉行为及味觉识别,并可能在小地老虎感受化学农药的过程中发挥作用。

秦川牛Snail2基因扩增、序列特征及表达特性分析

试验旨在扩增秦川牛Snail2基因,构建Snail2基因在其各组织不同发育阶段及脂肪细胞不同分化时期的时空表达规律,为进一步研究Snail2基因在牛脂肪沉积中的功能及调控作用奠定基础。以秦川牛为研究对象,经PCR扩增得到Snail2基因CDS区序列,运用生物信息学软件对其功能结构进行预测,同时采用实时荧光定量PCR检测Snail2基因在新生牛和成年牛各组织及脂肪细胞成脂分化过程中的时空表达谱。结果显示,秦川牛Snail2基因编码序列全长为952 bp。不同物种系统进化树结果表明,牛Snail2蛋白在家牛、水牛、山羊、绵羊中高度保守。磷酸化位点分析发现,存在41个潜在磷酸化位点,其中周期蛋白依赖性激酶1(cyclin dependent kinase 1,CDK1)、CDK5、CKⅡ、CKⅠ等多个细胞周期相关激酶参与了Snail2蛋白的磷酸化修饰。蛋白结构域预测发现,牛、人和鼠等8个物种中有8个相似Motif。Snail2蛋白二级结构主要由不规则卷曲构成,二、三级结构预测结果一致。Snail2基因启动子区序列分析发现1个CpG岛及E2F、C/EBPα(CCAAT/enhancer binding proteins alpha)、AP2和Sp1等与脂肪生成相关的转录因子结合位点。实时荧光定量PCR结果显示,Snail2基因在牛脂肪组织中呈现较高表达水平,且随着脂肪细胞成脂分化和牛生长发育过程均呈现上升趋势,表明Snail2基因在牛脂肪沉积过程中发挥重要作用。研究结果为进一步揭示Snail2基因通过影响脂肪细胞增殖和分化进而影响肉牛脂肪沉积作用机制奠定基础。

家蚕N-乙酰基转移酶基因BmNAT的克隆与表达分析

N-乙酰基转移酶(N-acetyltransferase,NAT)是昆虫体内一种催化乙酰基团在乙酰辅酶A和胺之间转移的酶,主要与色素沉积、生理节律等有关。对已公布的家蚕(Bombyx mori)N-乙酰基转移酶基因Bm NAT(Gen Bank登录号:NP_001040401.1)进行生物信息学分析:该基因序列全长763 bp,ORF为564 bp,编码187个氨基酸残基,分子质量21.4 k D;多序列比对表明Bm NAT与脐橙螟(Amyelois transitella)同源蛋白质的序列相似性最高。通过原核表达的方法制备了融合Bm NAT蛋白,经蛋白质纯化并免疫新西兰兔获得多克隆抗体。亚细胞定位显示Bm NAT主要存在于细胞质和细胞核中。利用Western blotting检测Bm NAT在家蚕不同发育时期和5龄幼虫各组织器官的表达谱,结果表明Bm NAT在蛾、卵期以及5龄幼虫的头部表达量较高,与Bm NAT的qRT-PCR检测结果基本一致,初步推断Bm NAT可能在家蚕的这些组织或发育时期发挥一定的生物学功能。流式细胞实验显示Bm NAT对细胞周期可能存在一定的影响。

中华蜜蜂NPC2基因家族克隆及表达模式分析

【背景】作为我国本土重要的资源昆虫,中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值,其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现,与昆虫嗅觉相关的尼曼匹克C2型蛋白(Niemann-Pick type C2 protein,NPC2)基因家族在低温时表达量上升。【目的】以中蜂NPC2家族基因为研究对象,克隆并分析其结构特征和表达谱以及高、低温处理下表达量的差异,为深入研究中蜂NPC2基因家族在中蜂低温适应的嗅觉感受功能提供参考。【方法】基于中蜂高、低温转录组测序结果,利用RT-PCR克隆获得中蜂NPC2基因ORF序列,进行系统进化树分析和三维结构预测,然后通过实时荧光定量PCR分析中蜂NPC2基因在不同发育时期、组织的时空表达谱,以及高、低温时的表达量变化。【结果】获得4个中蜂NPC2基因——AcNPC2a、AcNPC2b、AcNPC2c、AcNPC2d的ORF全长,分别为447、480、459和465 bp,编码148、159、152和154个氨基酸,预测蛋白分子量为16.12—18.53 kD,等电点分别为7.98、7.57、6.56和6.34。进化树分析显示AcNPC2与意大利蜜蜂的NPC2同源序列亲缘关系最近,与其他膜翅目昆虫NPC2也有一定相似性。实时荧光定量PCR结果显示,AcNPC2a在新出房蜂的腹部表达量最高,其次是在哺育蜂的腹部以及幼虫期;AcNPC2b在新出房蜂的胸部表达最高,在采集蜂的头部、胸部和后足也有表达;AcNPC2c在哺育蜂和采集蜂的触角中呈高丰度表达;AcNPC2d在采集蜂的头部表达量最高。经低温处理后,4个AcNPC2基因在采集蜂触角中的表达量均有所上升,但差异不显著。【结论】AcNPC2具有NPC2蛋白的保守结构,其基因家族成员在中蜂的时空表达谱中呈现多样性,其中AcNPC2c在触角中呈高丰度表达,表明其与中蜂嗅觉感受功能关系密切。AcNPC2基因家族在低温时采集蜂触角中表达量均有所上升,表明该基因家族有可能参与中蜂的低温适应性,或与初冬季访花行为有关。

长链非编码RNA AK046999在小鼠大脑皮质发育中的表达及功能

目的检测长链非编码RNA AK046999在小鼠大脑皮质发育过程中的表达及作用。方法 1)通过UCSC基因组浏览器获取其基因组座位,利用Coding Potential Calculator工具对其编码能力进行预测;2)原位杂交及免疫荧光技术确定其在大脑皮质发育过程中的表达谱;3)TALEN技术构建AK046999完全敲除小鼠,并且在DNA及RNA水平对其进行敲除鉴定;4)免疫荧光及TUNEL技术对敲除小鼠大脑皮质在发育过程的功能进行检测。结果 1)AK046999可认为是非编码RNA(Coding Potential Score<-1);2)AK046999在小鼠大脑皮质发育过程中,前体区相对高表达;3)成功构建了AK046999敲除小鼠;4)与对照相比,AK046999敲除小鼠中表达PAX6、TBR2和NEUROD2的细胞数量无明显改变,并且在这两组小鼠中凋亡细胞的数量无明显改变。结论 AK046999在发育期的小鼠大脑皮质表达,但敲除后不影响小鼠大脑皮质中神经祖细胞的增殖、分化和细胞凋亡过程。

埃及伊蚊丝氨酸蛋白酶抑制蛋白基因家族的筛选和表达谱分析

目的筛选并鉴定埃及伊蚊(Aedes aegypti)全基因组中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serine protease inhibitor,serpin)基因,分析其基因结构以及在不同发育时期和不同组织中的表达谱。方法运用生物信息学方法在埃及伊蚊全基因组数据库中筛选并鉴定埃及伊蚊serpin基因家族,利用Vector NTI11.0软件进行同源性比对、保守性分析,采用MEGA7.0软件构建系统进化树。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测埃及伊蚊不同发育时期(卵、Ⅰ~Ⅳ龄幼虫、蛹、雄蚊和未吸血雌蚊),以及未吸血雌蚊不同组织(唾液腺、中肠、脂肪体和卵巢)的serpin基因表达变化。结果从埃及伊蚊全基因组中筛选出26条serpin基因序列。生物信息学分析结果显示,19条具有信号肽,16条推测具有抑制酶活性。进化分析表明,埃及伊蚊serpin基因家族被分为A、B和C分支,B分支分为4组,每分支均具有同源性,且不同成员间在进化上相对保守。qRT-PCR结果显示,Aa SRPN25在雌蚊中特异性表达,相对表达量为0.074±0.015(P<0.01);Aa SRPN19~22在雄蚊中丰富表达;Aa SRPN23在Ⅰ龄幼虫时期特异性高表达,而且在唾液腺中也特异性高表达,相对表达量分别为22.9±5.28和4.24±1.39(P<0.01);Aa SRPN25在唾液腺中特异性高表达,相对表达量为74.44±25.76(P<0.01),Aa SRPN6、Aa SRPN14在中肠中的表达量最高,相对表达量分别为1.80±0.33、0.703±0.501;Aa SRPN17、Aa SRPN20在脂肪体中的表达量最高,相对表达量分别为0.34±0.09、0.15±0.03。结论从埃及伊蚊全基因组中筛选出26条serpin基因序列,其中19条具有信号肽,16条推测具有抑制酶活性的作用。