动物源食品中孕酮激素残留的时间分辨荧光免疫分析法的建立

该研究以孕酮为研究对象,设计并制备了新抗原,通过动物免疫得到特异性兔抗体,基于所得抗原和抗体,进一步优化了抗原抗体浓度、反应缓冲液种类及其pH值等关键参数,最终在国内首次建立了用于动物性食品中性激素孕酮残留快速检测时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)。该研究确定最优实验条件为:抗原0.30μg/mL、铕标抗体0.40μg/mL、pH值7.2的TBST工作缓冲液,并建立标准曲线,方法的线性范围为0.46~6.94μg/L,IC_(50)达1.79μg/L,与睾酮交叉反应率为1.25%,与雌二醇、雌三醇等激素无交叉反应。实际样品的平均添加回收率为82.0%~113.0%,批内批间变异系数<5%,与高效液相色谱法(HPLC)检测结果的相关性良好(r2=0.988)。结果表明该研究所建立的TRFIA检测方法准确可靠、特异性好、灵敏度高,完全可用于动物源食品中孕酮残留的快速检测。

时间分辨荧光免疫分析仪的校准方法研究

研究一种适用于时间分辨荧光原理的免疫分析仪校准方法。经过对时间分辨荧光免疫分析仪荧光特性、孵育舱温度、分析项目浓度示值误差,重复性等性能指标的实验和研究,建立该分析仪的校准方法。起草该分析仪的校准规范,提出了仪器的校准项目与技术指标,确定了校准用的仪器设备,设计了完备的校准方案,使时间分辨荧光免疫分析仪的量值准确、可靠、可溯源,为统一相关量值发挥重要的作用。

血清糖类抗原153基于磁珠的时间分辨荧光免疫分析试剂的研制

目的在传统的时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技术基础上,结合生物素-亲和素放大技术和磁性微粒技术优势,建立一项新方法进行血清中糖类抗原153(carbohydrate antigen153,CA153)含量的测定。方法利用磁性微粒表面的链霉亲和素分子与生物素-CA153包被抗体快速高效结合,从而在固相载体磁性微粒表面形成双抗体夹心复合物。并对新方法的各项性能指标进行评价。结果获得的CA153TRFIA线性方程为y=54638x+7052.2,R^(2)=0.9995;该方法的灵敏度为0.48U/mL,批内和批间的变异系数分别为2.09%~5.95%,1.54%~7.15%,平均回收率为94.48%,与其他肿瘤标志物无明显干扰,正常范围参考值为0~35U/mL。用该方法检测乳腺癌与健康体检者血清的CA153结果与化学发光法一致,相关系数为0.9782。结论该方法灵敏度优于传统技术,是TRFIA的一种新方法,反应时间短,操作简单,敏感度、特异性、准确度等均符合临床应用要求。

赭曲霉毒素A的高灵敏时间分辨荧光免疫分析

采用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术建立快速的高灵敏度的赭曲霉毒素A(OTA)全自动检测方法.将OTA-BSA作为免疫分子免疫Balb/c小鼠,OTA-KLH为筛选用抗原包被板,用间接酶联免疫分析(ELISA)法筛选出专一针对OTA的高效价的阳性克隆3G9,用杂交瘤细胞制备抗OTA单克隆抗体.用OTA-BSA包被96孔板为固相抗原,与游离OTA共同竞争有限的抗OTA单克隆抗体,以稀土离子Eu3+标记的羊抗鼠抗体进行示踪,采用间接竞争免疫分析方法在解离增强荧光免疫分析体系中建立OTA-TRFIA.该方法的灵敏度为0.03μg/L,测量范围为0.03￣1000μg/L,批内和批间变异分别为3.7%和5.3%,平均回收率为94.2%,与赭曲霉毒素B的平均交叉反应为3.7%,与黄曲霉毒素B1、牛血清白蛋白和苯基丙氨酸无交叉反应,说明抗体的特异性很好.8条不同时间进行的间接竞争OTA-TRFIA的效应点均值ED80、ED50、ED20分别为(0.33±0.02)μg/L、(1.44±0.08)μg/L和(5.22±0.12)μg/L,说明方法的稳定性好,样品经TRFIA和ELISA试剂盒同时检测OTA,两者的相关系数为0.925,结果相符.研究表明,OTA-TRFIA是目前报道的OTA检测中最灵敏的方法,该分析方法稳定性好,可测范围宽,具有很好的应用前景.

黄曲霉毒素B_1的高灵敏时间分辨荧光免疫分析

采用时间分辨荧光技术建立了高灵敏的黄曲霉毒素B1(AFB1)间接竞争免疫分析法(AFB1-TRFIA)。以AFB1-BSA为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗AFB1抗体;AFB1与辣根过氧化酶的联结物(AFB1-HRP)包被96孔板为固相抗原,与游离AFB1共同竞争有限的抗AFB1抗体;用稀土离子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪。该方法的灵敏度为0.01μg/L,测量范围为0.01—100μg/L,批内和批间变异分别为4.1%和6.8%,平均回收率为97.2%,与黄曲霉毒素B2的平均交叉反应为10%左右;黄曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B及HRP基本不干扰本方法对AFB1的检测。8条不同时间进行的AFB1-TRFIA的效应点值ED80、ED50、ED20分别为(0.07±0.01)μg/L、(0.63±0.02)μg/L和(12.5±0.47)μg/L。比较AFB1-TRFIA和AFB1-ELISA检测AFB1,两者的相关系数为0.917。研究表明,AFB1-TRFIA是目前报导的AFB1检测中最灵敏的方法,该分析方法稳定性好,可测范围宽,具有很好的应用前景。

时间分辨荧光免疫分析法间接测定雌二醇

以氯磺酰基噻吩甲酰三氟丙酮 ( CTTA)为铕 ( Eu)的螯合剂 ,羊抗鼠 ( SAM)的 Ig G为二抗 ,用 SAM- Ig G- CTTA- Eu作标记二抗 ,建立了以竞争抑制为基础的时间分辨荧光免疫分析测定游离雌二醇 ( E2 )的新方法。同均相方法相比灵敏度有很大提高 ,测定雌二醇 ( E2 )的线性范围为 2 .5～ 2 0 0 pg/m L,检测限为 2 .5 pg/m L。这一方法可望用于 E2

时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测的应用

近些年，生物标记技术不断的发展。免疫分析技术得到了快速的发展。例如放射免疫分析技术，由于放射分析技术存在污染性和局限性，限制其进一步发展与应用，继由放射免疫分析技术之后，又研究形成了各种非放射免疫技术，包括酶标记分析技术、荧光免疫分析技术、化学发光免疫分析技术、时间分辨荧光免疫分析（Time．resolvednuoreimmuoassay，TRFIA）技术等。

胃蛋白酶原双标记时间分辨荧光免疫分析及其初步临床应用

采用钐(Sm3+)标记抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体(PGⅠ)及铕(Eu3+)标记抗胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体(PGⅡ),建立了双标记时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA),同时检测人血清PGⅠ和PGⅡ.将抗PGⅠ单克隆抗体8003#、抗PGⅡ单克隆抗体8101#以一定比例共包被于96孔微孔板上,用Sm3+标记抗PGⅠ单抗8016#、Eu3+标记抗PGⅡ单抗8102#,采用双抗体夹心法建立PGⅠ/PGⅡ的双标记TRFIA.标准曲线由TRFIA检测仪自带的Log-LogB函数处理.PGⅠ可测范围为0.2～300μg/L,批内和批间变异系数(CV%)分别为5.2%和8.1%,平均回收率为96.9%;PGⅡ可测范围为0.05～55μg/L,批内和批间变异系数(CV%)分别为7.1%和11.7%,平均回收率为103.7%;双标记PGⅠ/PGⅡ-TRFIA与PGⅠ-ELISA法、PGⅡ-ELISA法的测定结果高度相关,具有较好的一致性,相关系数分别为0.9426和0.9396.检测300例健康人员的PGⅠ为(157.3±51.0)μg/L,PGⅡ为(10.6±5.9)μg/L,PGⅠ/PGⅡ比值为(14.8±4.3)μg/L.PGⅠ的正常参考值范围在55.3～259.3μg/L之间,PGⅡ正常参考值为<23μg/L,PGⅠ/PGⅡ>6.双标记PGⅠ/PGⅡ-TRFIA方法的研究在国内外尚未见报道,是一种灵敏、简便、快速、经济并可用于大批量样品筛查的方法,有利于各种胃病的大规模普查筛选及患者病程监测.

人附睾蛋白4时间分辨荧光免疫分析在妇科肿瘤诊断中的价值

目的:建立人附睾蛋白4(HE4)时间分辨荧光免疫分析(TRFIA),探讨血清HE4检测在妇科肿瘤诊断中的价值。方法:采用铕标记示踪,构建HE4的双抗体夹心TRFIA,并检测了225例受试者血清HE4水平,分析血清HE4在妇科肿瘤中的诊断意义,并探讨诊断子宫内膜癌、卵巢癌及宫颈癌的最佳参考值。结果:HE4 TRFIA工作线性范围10~10 000 pmol/L,灵敏度7.5 pmol/L,与CA125和CA199无交叉反应,批间变异系数小于10%,与化学发光法检测结果一致。子宫内膜癌、卵巢癌及宫颈癌组的血清HE4水平明显高于健康对照组,子宫肌瘤组与健康对照组无显著差异;随年龄增长,妇科良恶性肿瘤的患病风险增加。HE4在上述恶性肿瘤检测中ROC^(AUG)>0.5,运用本方法测定的参考值为60 pmol/L。结论:建立了稳定、准确的HE4 TRFIA,有助于妇科肿瘤的诊断。

环丙沙星时间分辨荧光免疫分析方法的建立与应用

建立基于时间分辨荧光免疫分析技术的环丙沙星(CPF)间接竞争检测方法。将环丙沙星-卵清白蛋白(CPF-OVA)包被于固相微孔板,CPF标准品或样品中CPF与CPF包被原(CPF-OVA)共同竞争限量的CPF抗体,用铕标羊抗兔IgG示踪,建立环丙沙星时间分辨荧光免疫分析方法(CPF-TRFIA);考察包被质量浓度、抗体稀释液、反应时间等对方法灵敏度的影响。结果表明:在优化条件下,该方法的检测限为0.5μg/L,半抑制质量浓度(IC5 0)为4.32μg/L,线性范围(IC20～IC80)为1.14～28.85μg/L;该方法对蜂蜜中CPF平均回收率为80.66%～100.30%,对牛奶中CPF的平均回收率为76.30%～95.22%,两者的平均批内和批间变异系数分别为7.42%和10.92%。CPF-TRFIA间接竞争法测定环丙沙星具有灵敏度高、特异性好、性能稳定的优点,适于高通量筛查。

时间分辨荧光免疫分析的新进展

对2003~2015年间时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)的新进展作了综述,包括荧光共振能量转移TRFIA、酶放大TRFIA和基于纳米颗粒的TRFIA,以及时间分辨荧光免疫分析与流动注射分析、实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)等技术联用的应用情况,并对TRFIA的发展前景进行了展望(引用文献82篇)。

时间分辨荧光免疫分析方法检测烟草中菌核净残留

建立了简便、灵敏地检测烟草中菌核净残留的时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA),及配套的无净化的快速前处理技术。采用镧系元素螯合物Eu-N1标记亲和纯化后的羊抗兔IgG示踪抗体。采用间接竞争TRFIA法建立了菌核净标准抑制曲线,方法的检出限I10为2.0μg/L;抑制终浓度I50为32.00μg/L;检测线性范围为4～128μg/L。考察了丙酮提取后33%,10%和1%的烟草基质对菌核净-TRFIA分析方法的影响,表明在1%烟叶基质条件下,建立的菌核净的抑制曲线的线性范围与标准抑制曲线趋于平行,确定烟草样品的前处理稀释倍数为100倍,计算得到基质影响因子(Im)为17.1。对烟叶样品中添加1,7和24mg/L的菌核净标样,连续3d的添加回收实验表明,方法的回收率为73%～128%,相对标准标准偏差(RSD)在4.3%～13.2%之间;烟草中菌核净的实际最低检出限为1mg/L。本方法可望用于烟草中菌核净残留的快速筛选检测。

时间分辨荧光免疫分析的研究进展及应用

时间分辨荧光免疫分析(Time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是一种新型的体外超微量分析技术。它具有高精度、自动化、大样本快速测定(1～2h就能出结果)等技术优点。其在灵敏度和准确性方面明显高于ELISA,特异性又明显高于聚合酶链反应(PCR)。因而,其应用已不再局限于临床诊断,已渗透入生物学研究的各个领域。本文就该技术的研究进展及应用做一简要综述。

抗HBc时间分辨荧光免疫分析法的建立

目的 用竞争法建立抗HBc时间分辨荧光免疫分析 (TRFIA)方法。方法 以基因重组HBcAg包被板 ,Eu3 + -异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸 (Eu3 + DTTA)标记抗HBc IgG单克隆抗体 ,建立抗HBcTRFIA方法。数据采用Log Logit函数和四参数Logistic函数数据处理程序处理。结果 方法的批内和批间变异系数分别为 2 30 %和 6 30 % ,回收率为 96 72 % ,灵敏度为 0 2NCU/ml。本方法与抗HBs和抗HBe无交叉反应 ,Eu3 + 标记物稳定 6个月以上。结论 TRFIA是一种新的抗HBc免疫检测技术 ,具有灵敏度高和稳定性好等优点 ,能够用于定量测定抗HBc

基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪研究

基于时间分辨荧光免疫分析和免疫层析技术的原理,研制了一种新型的时间分辨荧光免疫分析仪。与现有的时间分辨荧光分析仪不同,它所检测的是以Eu3+离子及其螯合物为标记物的免疫层析试纸条。通过测量免疫反应后试纸条检测带上Eu3+螯合物的含量,参照标准浓度曲线就可以定量得到待测样品溶液的浓度。实验表明,仪器的最低检测浓度可达到ng/mL量级,测量的相对标准偏差小于3%,在5～103ng/mL浓度范围内具有良好的线性响应特性,相关系数R2=0.9997。

P-选择素时间分辨荧光免疫分析法的建立及临床应用

目的 建立时间分辨荧光免疫分析法 (TRFIA)用于检测血栓形成相关疾病患者的血浆P 选择素的含量 ,并探讨其临床意义。方法 用抗人血小板单抗SZ 5 1 IgG包被 ,将Eu3+ N (对 异硫氰酸苄基 ) 二乙烯四乙酸与另一个血小板单抗S12连接以制备Eu3+ S12示踪剂 ,β 二酮为发光增强剂 ,采用平衡饱和法建立时间分辨荧光免疫分析法 (TRFIA)用于分析糖尿病、高血脂、脑梗塞患者及正常人血浆中P 选择素含量的变化 ,并与流式细胞术 (FCM)和酶标记免疫吸附分析法 (ELISA)作比较。结果 方法灵敏度为 0 98ng/ml,批内和批间CV分别为 4 2 3 %和 6 6 7% ,平均回收率为 97 2 4% ,可测范围为 4 1～ 80ng/ml。应用TRFIA测定 2 2例高血脂、18例脑梗塞患者和 2 0例正常人血浆中P 选择素含量 ,分别为 8 0 8± 1 4ng/ml,12 5 1± 3 6ng/ml和19 0 4± 7 9ng/ml,显著高于正常人 (3 0 7± 1 6 4ng/ml) (P <0 0 1)。同时与ELISA和FCM方法检测血浆内P 选择素和血小板膜表面表达情况作比较 ,结果一致。结论 TRFIA检测血浆P 选择素的方法可靠、灵敏、方便 。

胃蛋白酶原Ⅱ时间分辨荧光免疫分析法的建立

建立胃蛋白酶原Ⅱ (PGⅡ )的时间分辨荧光免疫分析法 (TRFIA)。包被PGⅡ单抗 810 1# 和使用DTTA络合Eu3 + 标记PGⅡ单抗 810 2 # ,建立PGⅡTRFIA。结果用Log -Logit函数和四参数Logit函数数据处理。批内和批间CV分别为 2 .1%和 3.8% ,平均回收率为 10 4 .6 % ,灵敏度为 0 .0 2 μg/L。标准曲线呈直线 ,ED50 为 16 .2 1μg/L。与PGⅠ、AFP、CA5 0、CA12 5及CA2 4 2等无交叉反应。Eu3 + 标记单抗在 - 30℃保存 ,可达一年以上 ,免疫活性基本无损失。同批试剂连续分析 8个月结果稳定 ,与IRMA测定结果基本吻合。应用TRFIA检测血清PGⅡ具有灵敏度高、操作简便和时间短等特点 ,是一种适用于人群胃病普查的良好方法 ,具有推广应用价值。

T-2毒素的高灵敏时间分辨荧光免疫分析

以时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法建立快速灵敏的T-2毒素的全自动检测方法。采用T-2-BSA包被96孔板作为固相抗原,与游离的T-2竞争有限的抗T-2单克隆抗体,以Eu3+标记的羊抗鼠抗体示踪,采用间接竞争免疫分析方法在解离增强荧光免疫分析体系中建立T-2-TRFIA。同时对这一方法的稳定性、灵敏度、回收率和特异性进行考核。此方法灵敏度为0.2μg/L,测量范围0.2～500μg/L,批内变异为7.5%,批间变异为12.7%,平均回收率为89.6%。与赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、牛血清白蛋白无交叉反应。10条不同时间进行的间接竞争T-2-TRFIA的效应点均值ED80、ED50和ED20分别为2.66,6.97,29.11μg/L。同时,用TRFIA和ELISA试剂盒同时检测T-2毒素,在ELISA和TRFIA产品的共同可测范围之内,两者的相关系数为0.926。

间接竞争时间分辨荧光免疫分析法检测稻米中Cry1C毒素

利用免疫新西兰大白兔制备Cry1C毒素多克隆抗体,建立间接竞争时间分辨荧光免疫分析（CI-TRFIA）方法,用于稻米中Cry1C毒素的残留检测。通过4次免疫,采集Cry1C毒素多克隆抗体血清,并用饱和硫酸铵沉淀和Protein A柱纯化,测定抗体效价;以制备Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为检测抗体,建立Cry1C毒素的CI-TRFIA检测方法,并进行抗原类似物的特异性分析和Cry1C毒素在稻米中的添加回收试验。结果表明：获得的多克隆抗体质量浓度为3.86 mg·mL^-1,效价为1∶48 000;建立的CI-TRFIA检测方法,其灵敏度（IC10）为0.074 ng·mL^-1,中抑制浓度（IC50）为60.16 ng·mL^-1,线性检测范围（IC20~IC80）为0.96~1 633.60 ng·mL^-1;对Cry1B、Cry1Ab和Cry1Ac均有一定的交叉反应;添加回收试验的批内、批间回收率为84.53%~107.12%,变异系数为6.05%~11.24%。结论：该检测方法稳定性和重复性较好,可以满足Cry1C毒素的检测要求。