一种基于光子计数技术的时间分辨荧光免疫分析系统设计

以稀土荧光配合物作为标记物的时间分辨荧光免疫测定法在医学与生命科学的实践与研究中正发挥着越来越重要的作用.为此,设计了一种结构简单、成本低廉的基于FPGA的时间分辨光子计数器系统,改进了原有的Prony算法从而实现了对双组分五参数荧光信号的处理,并使用异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸络合铕(DTTA-Eu3+)和模拟的双组分荧光信号对系统和算法进行了实验验证.实验结果表明,系统对于DTTA-Eu3+的检测具有较高的准确度与线性度,相关系数r=0.996 2.对于双组分荧光信号,当两个荧光信号的差值在10倍以上时,使用改进后的Prony算法进行处理具有较高准确度,误差低于5%.

全自动时间分辨荧光免疫分析系统EASYCUTA分析方法性能验证

目的建立时间分辨荧光免疫的方法学性能验证方案和实验方法。方法参考CNAS-CL02:《医学实验室质量和能力认可准则》(ISO 15189:2012)对医学实验室检测系统性能评价的相关要求,结合实际工作需求,设计实验验证方案,并对全自动时间分辨荧光检测仪EASYCUTA测定乙肝五项,TP-Ab,HCV-Ab,HIV-Ab的精密度、正确度、线性分析测量范围、可检测极限、参考区间、分析灵敏度,抗干扰能力,交叉污染,方法学对比等进行验证和评价,并将检测结果与厂商(苏州新波公司)提供的性能指标进行比较。结果 EASYCUTA全自动时间分辨荧光检测系统检测HBV-M,TP,HCV,HIV项目的精密度、正确度、分析测量范围、可报告范围、参考区间、分析灵敏度、抗干扰能力、交叉污染,等均符合国际公认质量要求。方法学比对中,乙肝五项与Rochee601的阴阳性符合率>95%、K值评级为"优"。术前四项(HBsAg、TP、HCV、HIV)与Abbott i2000的阴阳性符合率>95%、K值评级为"优"。方法学对比合格。结论 EASYCUTA全自动时间分辨荧光检测仪测定乙肝五项,TP-Ab,HCV-Ab,HIV-Ab的主要分析性能验证结果与厂商说明书提供的分析性能一致,能够满足临床要求。本研究对规范医学实验室建设以及提供仪器检测质量具有重要的意义。

动物源食品中孕酮激素残留的时间分辨荧光免疫分析法的建立

该研究以孕酮为研究对象,设计并制备了新抗原,通过动物免疫得到特异性兔抗体,基于所得抗原和抗体,进一步优化了抗原抗体浓度、反应缓冲液种类及其pH值等关键参数,最终在国内首次建立了用于动物性食品中性激素孕酮残留快速检测时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)。该研究确定最优实验条件为:抗原0.30μg/mL、铕标抗体0.40μg/mL、pH值7.2的TBST工作缓冲液,并建立标准曲线,方法的线性范围为0.46~6.94μg/L,IC_(50)达1.79μg/L,与睾酮交叉反应率为1.25%,与雌二醇、雌三醇等激素无交叉反应。实际样品的平均添加回收率为82.0%~113.0%,批内批间变异系数<5%,与高效液相色谱法(HPLC)检测结果的相关性良好(r2=0.988)。结果表明该研究所建立的TRFIA检测方法准确可靠、特异性好、灵敏度高,完全可用于动物源食品中孕酮残留的快速检测。

时间分辨荧光免疫分析仪的校准方法研究

研究一种适用于时间分辨荧光原理的免疫分析仪校准方法。经过对时间分辨荧光免疫分析仪荧光特性、孵育舱温度、分析项目浓度示值误差,重复性等性能指标的实验和研究,建立该分析仪的校准方法。起草该分析仪的校准规范,提出了仪器的校准项目与技术指标,确定了校准用的仪器设备,设计了完备的校准方案,使时间分辨荧光免疫分析仪的量值准确、可靠、可溯源,为统一相关量值发挥重要的作用。

时间分辨荧光免疫分析技术与牦牛肉兽药残留检测研究进展

时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolved fluorescence immunoassay.TRFIA)是一种以镧系元素或其微球作为标记物,测量标记物所发射荧光标记分析技术,其特点是灵敏度高且无放射性污染[1]。由于TRFIA技术有着传统方法所不具备的检测成本低,检测速度快等诸多优势,因此TRFIA技术为牦牛肉质安全检测开辟一条崭新的检测途径。该文就TRFIA技术及其在牦牛肉质安全检测应用进展做一简要综述。

乙肝肝炎病毒检测中荧光定量PCR法与时间分辨免疫荧光的对比分析

探析荧光定量PCR法与时间分辨免疫荧光在乙肝肝炎病毒检测中的应用效果。方法 选用96例疑似乙肝患者,均进行荧光定量PCR法与时间分辨免疫荧光病毒检测,以细菌培养作为金标准,比较不同检测手段的阳性检出率、检验结果及检测效能。结果 荧光定量PCR法的检测符合率、灵敏度,高于时间分辨免疫荧光法,而特异度低于时间分辨免疫荧光法。结论 荧光定量PCR法和时间分辨免疫荧光两种方法各有优缺点,适用于不同的检测环境和需求。在实际应用中,需要根据检测要求和实际情况进行选择,确保有效性和准确性。

S100B时间分辨荧光免疫检测试剂盒的制备及性能评价

目的:制备一种快捷、准确、定量检测血清中S100B蛋白浓度的时间分辨荧光免疫检测试剂盒,并对其进行性能评价。方法:使用时间分辨荧光微球标记的抗S100B多克隆抗体及兔IgG抗体、标记垫、样品垫、S100B硝酸纤维素膜板、吸水纸制备试纸条,组装卡壳得到S100B时间分辨荧光免疫层析试剂盒。通过标准曲线、准确度、最低检测限、线性区间、特异度、重复性、稳定性等检测对该试剂盒进行性能评估。采用该试剂盒对某地区199例健康者血清及血浆样本的参考区间进行研究,并采用同步盲法测试该试剂盒与罗氏Elecsys S100检测试剂盒的临床应用性能,评估2种试剂盒对于142例样本检测结果的一致性。结果:该试剂盒所得标准曲线方程为y=(1.13302+1.75224)/[1+(x/1.08220)×(-0.60352)]-1.75224,R2=0.99908,线性范围为[0.05,30]ng/mL。该试剂盒可满足准确度相对偏差在±15%内、最低检测限≤0.05 ng/mL、特异度相对偏差在±15%内、批内差和批间差的变异系数均<15%的产品设计要求。稳定性检测结果标明该试剂盒可在2~30℃条件下有效保存12个月。同时,通过该试剂盒测得血清及血浆样本参考区间均<0.3 ng/mL。临床验证结果表明该试剂盒与罗氏Elecsys S100检测试剂盒的测定结果具有高度一致性(Kappa=0.9061>0.80),符合标准。结论:该试剂盒可快捷、准确、定量检测血清中S100B蛋白浓度,为神经类疾病、自身免疫病性疾病、脑血管疾病等的诊断与治疗提供了参考。

FQ-PCR检测乙型肝炎病毒DNA与时间分辨免疫荧光法检测乙肝五项在乙肝诊断中的应用价值

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测乙型肝炎病毒(HBV)-DNA与时间分辨免疫荧光法检测乙肝五项在乙肝诊断中的应用价值。方法选择2021年1月至2023年10月本院接收的82例疑似乙肝患者作为研究对象,均通过FQ-PCR实施HBV-DNA检测,同时予以时间分辨免疫荧光法检测乙肝五项[乙肝病毒核心抗体(HBcAb)、乙肝病毒e抗体(HBeAb)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗体(HBsAb)],并分析检测结果。结果82例患者中,HBV-DNA阳性率为70.73%(58/82)。82例患者中,组合A(HBcAb+HBeAg+HBsAg阳性)占比91.46%(75/82),组合B(HBeAb+HBsAg阳性)占比63.41%(52/82),组合C(HBcAb+HBeAb+HBsAg阳性)占比37.80%(31/82),组合D(HBcAb+HBeAb+HBsAb阳性)占比6.10%(5/82),组合E(HBeAg+HBsAg阳性)占比64.63%(53/82)。组合A、组合B、组合C、组合D、组合E中HBV-DNA阳性率分别为53.33%(40/75)、7.69%(4/52)、29.03%(9/31)、40.00%(2/5)、5.66%(3/53),组合A中HBV-DNA阳性率均高于其他各项组合,差异具有统计学意义(P<0.05)。FQ-PCR检测HBV-DNA联合时间分辨免疫荧光法检测乙肝五项诊断乙肝的准确度、灵敏度高于单独FQ-PCR检测HBV-DNA及时间分辨免疫荧光法检测乙肝五项,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论在乙肝诊断中,FQ-PCR检测HBV-DNA与时间分辨免疫荧光法检测乙肝五项各具优势,积极联合应用有助于进一步提升诊断效能。

血清糖类抗原153基于磁珠的时间分辨荧光免疫分析试剂的研制

目的在传统的时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技术基础上,结合生物素-亲和素放大技术和磁性微粒技术优势,建立一项新方法进行血清中糖类抗原153(carbohydrate antigen153,CA153)含量的测定。方法利用磁性微粒表面的链霉亲和素分子与生物素-CA153包被抗体快速高效结合,从而在固相载体磁性微粒表面形成双抗体夹心复合物。并对新方法的各项性能指标进行评价。结果获得的CA153TRFIA线性方程为y=54638x+7052.2,R^(2)=0.9995;该方法的灵敏度为0.48U/mL,批内和批间的变异系数分别为2.09%~5.95%,1.54%~7.15%,平均回收率为94.48%,与其他肿瘤标志物无明显干扰,正常范围参考值为0~35U/mL。用该方法检测乳腺癌与健康体检者血清的CA153结果与化学发光法一致,相关系数为0.9782。结论该方法灵敏度优于传统技术,是TRFIA的一种新方法,反应时间短,操作简单,敏感度、特异性、准确度等均符合临床应用要求。

犬冠状病毒时间分辨免疫荧光分析方法的建立及初步应用

探索建立犬冠状病毒(CCV)的时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)方法并制备试剂盒,并对试剂盒的性能进行初步的评价。本研究将抗CCV的单克隆抗体(MAb)8D6作为包被抗体,用Eu^(3+)标记的7E10 mAb作为检测抗体,制备双抗体夹心法TRFIA试剂盒,并对试剂盒的准确度、特异性、重复性、稳定性、临床样本检测等性能进行评估。本研究制备的CCV时间分辨免疫荧光试剂盒灵敏度为0.68 ng/mL;各浓度CCV标准品在不同水平的稀释度回收率在94.6%~105.6%;同步检测CPV、CD、CPIV、CAV-1标准品均为阴性,特异性好;批内CV为1.91%~5.03%,批间CV为1.82%~6.03%,重复性好;试剂盒在4℃保存6个月,37℃保存7 d后,试剂盒各项性能均无明显变化;临床样本检测结果与RT-PCR方法结果一致。本研究制备的CCV TRFIA试剂盒具有灵敏度、准确度高,重复性、稳定性良好的优点,能够对CCV的临床样本进行大量的筛查,为CCV患病犬的早期确诊提供了一种全新的技术手段。

丙肝病毒抗体检测运用时间分辨荧光分析法和酶联免疫法的应用价值观察

研究分析时间分辨荧光分析法和酶联免疫法于丙肝病毒抗体检测中应用效果。方法 丙型肝炎行丙肝病毒抗体检测患者2022年1月至同年12月选取521例,运用时间分辨荧光分析法和酶联免疫法做丙肝病毒抗体检测,检测作用做比对分析。结果 时间分辨荧光分析法对于丙肝病毒抗体检出率与酶联免疫法丙肝病毒抗体检出率比对无差异(P>0.05),丙肝病毒抗体检出情况与金标准比对,时间分辨荧光分析法较酶联免疫法准确率、灵敏度较高,优于酶联免疫法(P<0.05)。结论 丙肝病毒抗体检测,时间分辨荧光分析法行检测,对于丙肝病毒抗体有较高,且检测精准度、灵敏度良好。

高灵敏度玉米赤霉烯酮时间分辨荧光快速定量检测卡的研发和应用

成功研发了一种灵敏度高、准确度好、快速、简易的双T线的玉米赤霉烯酮(ZEN)时间分辨荧光快速定量检测卡。通过对比ZEN检测卡检测线数量(单T线、双T线)的灵敏度,主要利用双T线的增补作用优势抬高灵敏度。对比了独立C线、非独立C线体系工艺,利用非独立C线工艺,C值与T值呈现负相关来提高灵敏度。筛选出羊抗鼠-自身鼠抗非独立C线工艺,在其基础上进一步筛选标记抗体量(5、10、20、30μg/mL),选择标记抗体量10μg/mL效价25429,10~500μg/kg抑制率33.57%~98.30%,灵敏度、效价最佳。用液相色谱与玉米赤霉烯酮(ZEN)时间分辨荧光快速定量检测卡同时检测不同基质的样本,两者的符合度很高,准确度在90.89%~119.33%,浓度CV6.18%。研究表明,用荧光层析检测卡检测粮食谷物中玉米赤霉烯酮的分析方法稳定性好,货架期符合要求,可测范围宽,具有很好的应用前景。

呕吐毒素和玉米赤霉烯酮二合一时间分辨荧光定量快速检测卡的研发和优化

成功研发及优化一种基于时间分辨荧光纳米微球的呕吐毒素/玉米赤霉烯酮真菌毒素二合一荧光定量快速检测卡(简称DZ检测卡),同种样本仅需一次提取检测,8 min内即可得到两个项目的检测结果,快速、简单易操作。本项目成功优化了基于时间分辨纳米微球的呕吐毒素/玉米赤霉烯酮真菌毒素二合一荧光定量快速检测卡的制备工艺,玉米赤霉烯酮(简称ZEN)的均一性差、呕吐毒素(简称DON)的灵敏度低、C线波动大、样本前处理等问题。通过对时间分辨荧光微球不同粒径标记抗体,确定了DZ检测卡中DON胶乳所用的荧光微球为298 nm,解决了DON灵敏度低的问题;通过对喷膜稀释倍数的优化,确定了胶乳的稀释倍数,解决了ZEN均一性差的问题;通过对划膜位置的筛选,确定了ZEN、DON、C线的划膜位置NC膜距样品垫的距离依次为T1(14 mm)、T2(10 mm)、C(6mm);通过对划膜液体系的优化,确定C线划膜液为10 mM NMS+2%蔗糖,解决了C线值波动大的问题;通过对样本前处理提取液的优化,确定了提取液为50%乙醇+2%NaCl,检测ZEN的准确度在95.83%~116.71%,检测DON的准确度在96.53%~110.36%。玉米、小麦样本的检测可用一条标准曲线。

时间分辨荧光免疫法检测胎盘生长因子的方法建立及性能评价

目的建立检测胎盘生长因子(placental growth factor,PLGF)的时间分辨荧光免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA),并对其性能进行评价。方法利用捕获PLGF单克隆抗体包被微孔板,铕标记检测PLGF单克隆抗体,建立一种双抗体夹心TRFIA定量测定孕妇血清中的PLGF浓度。对该方法的检测低限、生物检测限、功能灵敏度、精密度、线性、干扰试验、交叉反应试验和HOOK效应等性能指标进行评价。选择125例孕期在9~40周,无溶血、黄疸和脂血的孕妇血清剩余样本,用于方法学比对研究,比对试验结果的相关性采用线性回归分析。结果该方法的捕获抗体包被浓度为7.0μg/ml,铕标记物使用工作稀释度为1:500,样本最适反应时间为90 min,检测低限为1.00 pg/ml,生物检测限为8.00 pg/ml,功能灵敏度为10.00 pg/ml,批内CV和批间CV均在5.00%以内,线性范围为9.00~10500.00 pg/ml,分别在低浓度和高浓度质控品中添加有干扰物质的16种干扰样本与基础样本检测结果的相对偏倚在-3.49%~2.20%内;检测5000 pg/ml糖基化PLGF-1,5000 pg/ml糖基化PLGF-2,5000 pg/ml未糖基化PLGF-3,10000 pg/ml未糖基化血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)/PLGF-1异二聚体,50000pg/ml糖基化VEGF165和40000 pg/ml可溶性FMS样酪氨酸激酶-1,交叉反应率分别为41.82%,27.86%,19.68%,0.042%,0.063%和0.0045%;检测样品PLGF浓度高达115000 pg/ml时仍未出现HOOK效应;样本PLGF浓度在5.74~4197.00 pg/ml间,与电化学发光法(electrochemiluminescence,ECL)检测结果的线性回归方程为Y=1.0709X-30.192,(r=0.9806,tr=55.42,P<0.05)。结论该方法灵敏度高、精密度好、线性范围宽、抗干扰能力强、特异度好、检测范围宽,与参比方法检测结果的相关性良好,可以满足临床需要。

时间分辨荧光免疫分析法直接测定雌二醇

合成了雌二醇抗原,并获得了雌二醇单克隆抗体,通过酶联免疫吸附法测得效价为1.O×10~7.使用洗脱增强-时间分辨荧光免疫分析法测定了血清中的雌二醇,浓度范围为1.0×10^(-2)～1.0×10~3μg/L,最低检出限为5.6ng/L,批内RSD%小于3.7%,批间RSD%小于7.5%.将测定结果与放射免疫分析法作了比较.

赭曲霉毒素A的高灵敏时间分辨荧光免疫分析

采用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术建立快速的高灵敏度的赭曲霉毒素A(OTA)全自动检测方法.将OTA-BSA作为免疫分子免疫Balb/c小鼠,OTA-KLH为筛选用抗原包被板,用间接酶联免疫分析(ELISA)法筛选出专一针对OTA的高效价的阳性克隆3G9,用杂交瘤细胞制备抗OTA单克隆抗体.用OTA-BSA包被96孔板为固相抗原,与游离OTA共同竞争有限的抗OTA单克隆抗体,以稀土离子Eu3+标记的羊抗鼠抗体进行示踪,采用间接竞争免疫分析方法在解离增强荧光免疫分析体系中建立OTA-TRFIA.该方法的灵敏度为0.03μg/L,测量范围为0.03￣1000μg/L,批内和批间变异分别为3.7%和5.3%,平均回收率为94.2%,与赭曲霉毒素B的平均交叉反应为3.7%,与黄曲霉毒素B1、牛血清白蛋白和苯基丙氨酸无交叉反应,说明抗体的特异性很好.8条不同时间进行的间接竞争OTA-TRFIA的效应点均值ED80、ED50、ED20分别为(0.33±0.02)μg/L、(1.44±0.08)μg/L和(5.22±0.12)μg/L,说明方法的稳定性好,样品经TRFIA和ELISA试剂盒同时检测OTA,两者的相关系数为0.925,结果相符.研究表明,OTA-TRFIA是目前报道的OTA检测中最灵敏的方法,该分析方法稳定性好,可测范围宽,具有很好的应用前景.

黄曲霉毒素B_1的高灵敏时间分辨荧光免疫分析

采用时间分辨荧光技术建立了高灵敏的黄曲霉毒素B1(AFB1)间接竞争免疫分析法(AFB1-TRFIA)。以AFB1-BSA为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗AFB1抗体;AFB1与辣根过氧化酶的联结物(AFB1-HRP)包被96孔板为固相抗原,与游离AFB1共同竞争有限的抗AFB1抗体;用稀土离子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪。该方法的灵敏度为0.01μg/L,测量范围为0.01—100μg/L,批内和批间变异分别为4.1%和6.8%,平均回收率为97.2%,与黄曲霉毒素B2的平均交叉反应为10%左右;黄曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B及HRP基本不干扰本方法对AFB1的检测。8条不同时间进行的AFB1-TRFIA的效应点值ED80、ED50、ED20分别为(0.07±0.01)μg/L、(0.63±0.02)μg/L和(12.5±0.47)μg/L。比较AFB1-TRFIA和AFB1-ELISA检测AFB1,两者的相关系数为0.917。研究表明,AFB1-TRFIA是目前报导的AFB1检测中最灵敏的方法,该分析方法稳定性好,可测范围宽,具有很好的应用前景。

环丙沙星时间分辨荧光免疫分析方法的建立与应用

建立基于时间分辨荧光免疫分析技术的环丙沙星(CPF)间接竞争检测方法。将环丙沙星-卵清白蛋白(CPF-OVA)包被于固相微孔板,CPF标准品或样品中CPF与CPF包被原(CPF-OVA)共同竞争限量的CPF抗体,用铕标羊抗兔IgG示踪,建立环丙沙星时间分辨荧光免疫分析方法(CPF-TRFIA);考察包被质量浓度、抗体稀释液、反应时间等对方法灵敏度的影响。结果表明:在优化条件下,该方法的检测限为0.5μg/L,半抑制质量浓度(IC5 0)为4.32μg/L,线性范围(IC20～IC80)为1.14～28.85μg/L;该方法对蜂蜜中CPF平均回收率为80.66%～100.30%,对牛奶中CPF的平均回收率为76.30%～95.22%,两者的平均批内和批间变异系数分别为7.42%和10.92%。CPF-TRFIA间接竞争法测定环丙沙星具有灵敏度高、特异性好、性能稳定的优点,适于高通量筛查。

时间分辨荧光免疫分析法间接测定雌二醇

以氯磺酰基噻吩甲酰三氟丙酮 ( CTTA)为铕 ( Eu)的螯合剂 ,羊抗鼠 ( SAM)的 Ig G为二抗 ,用 SAM- Ig G- CTTA- Eu作标记二抗 ,建立了以竞争抑制为基础的时间分辨荧光免疫分析测定游离雌二醇 ( E2 )的新方法。同均相方法相比灵敏度有很大提高 ,测定雌二醇 ( E2 )的线性范围为 2 .5～ 2 0 0 pg/m L,检测限为 2 .5 pg/m L。这一方法可望用于 E2

癌胚抗原的时间分辨免疫荧光分析及其诊断试剂的研制

目的：利用时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）技术，建立一种人血清癌胚抗原（CEA）的快速全自动检测方法并研制其诊断试剂。方法：采用双抗体夹心法（用1株抗CEA的mAbM86160M用于包被微孔板，另1株抗CEA的mAb M86110M用于标记铕）建立CEA—TRFIA，增强液采用B-二酮体为主的发光增强系统。结果：CEA-TRFIA的线性测量范围为（1～560）μg／L，分析的灵敏度为0．28μg／L，批内和批间的变异系数（CV）分别为7．2％～8．6％和8．9％～13．2％。与AFP，CA12—5、CA19—9和白蛋白均无交叉反应，与CA15—3的交义反应值为1．62μg／L。将1000份血清标本用本法与国外罗氏化学发光试剂盒同时检测，其相关系数（r）为0．946。结论：CEA—TRFIA的各项指标均达到临床检测的要求，可替代国外同类检测试剂盒，用于临床血清CEA水平的测定。