短发夹RNA介导RNA干扰的时间和剂量效应研究

用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术抑制哺乳动物细胞中外源报告基因的表达,以探讨该过程中RNAi作用的剂量和时间效应.应用Lipofectamine 2000将外源报告基因的表达载体与编码短发夹RNA(shorthairpin RNA,shRNA)的质粒共转染HEK293H细胞,观察shRNA载体对报告基因的抑制效应.转染后,shRNAs的瞬时表达可特异地抑制细胞内报告基因的表达.在共转染后12,24,48,60,72,96 h时检测EGFP(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因mRNA及蛋白质表达水平,结果显示,EGFPmRNA及蛋白质表达在12 h时略有降低,24～48 h时表达逐渐降低,48～72 h时降低最明显,其后EGFP表达水平逐渐恢复.提示该过程中RNAi效应呈现由弱到强、又由强到弱的逐渐消逝趋势.共转染一系列剂量比例的EGFP干扰载体与靶载体的结果表明,在一定剂量范围内,RNA干扰载体所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关,当其剂量进一步加大足以抑制外源基因表达时,抑制效应则维持在一'平台期'.此外,通过RNAi抑制HeLa细胞、HEK293细胞中荧光素酶基因的表达,荧光素酶活性变化也表现出上述类似的效应.这些结果表明,在体外哺乳动物细胞中,基于表达载体的RNAi作用呈现剂量和时间依赖性效应.这为基于载体表达的RNAi技术应用研究提供了一定的理论参考及依据.