BNP和IL-6双标记时间分辨免疫荧光检测方法的建立及初步应用

目的研制一种脑钠肽(BNP)、白细胞介素-6(IL-6)的双标记时间分辨免疫荧光分析方法(TRFIA)并对其性能进行初步评价。方法将抗BNP和IL-6单克隆抗体(MAb)作为包被抗体包被在96孔板,用Eu3+和Sm3+分别标记另一配对抗体作为检测抗体,建立双抗体夹心TRFIA分析法并制备成试剂盒。进行灵敏度、准确度、重复性、特异性、稳定性和临床样本比对等实验评价其检测性能。结果制备的双标记时间分辨免疫荧光试剂盒对BNP检测的线性范围为10 pg/mL~5000 pg/mL,灵敏度为8.65 pg/mL,对IL-6检测的线性范围为1 pg/mL~1000 pg/mL,灵敏度为5.36 pg/mL。BNP的回收率在91.49%~99.16%,批内CV在5.73%~8.96%,批间CV在8.42%~11.73%;IL-6的回收率在93.95%~111.50%,批内CV在7.32%~10.07%,批间CV在9.40%~11.30%。与血清中常见的脓毒血症检测指标均无明显的交叉反应。试剂盒能够在4℃稳定保存半年,37℃稳定保存7 d。对临床样本的检测发现,该方法参考区间Cut-off值BNP:46.01 pg/mL,IL-6:13.62 pg/mL;检测结果与临床诊断结果一致,准确性较好。结论建立的BNP和IL-6双标记TRFIA方法具有高灵敏度、高特异性、高准确率、方便快捷等优点,可作为预警脓毒症发生、预测脓毒症病情程度及临床预后的一种新的实验室检测方法。

胃蛋白酶原双标记时间分辨荧光免疫分析及其初步临床应用

采用钐(Sm3+)标记抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体(PGⅠ)及铕(Eu3+)标记抗胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体(PGⅡ),建立了双标记时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA),同时检测人血清PGⅠ和PGⅡ.将抗PGⅠ单克隆抗体8003#、抗PGⅡ单克隆抗体8101#以一定比例共包被于96孔微孔板上,用Sm3+标记抗PGⅠ单抗8016#、Eu3+标记抗PGⅡ单抗8102#,采用双抗体夹心法建立PGⅠ/PGⅡ的双标记TRFIA.标准曲线由TRFIA检测仪自带的Log-LogB函数处理.PGⅠ可测范围为0.2～300μg/L,批内和批间变异系数(CV%)分别为5.2%和8.1%,平均回收率为96.9%;PGⅡ可测范围为0.05～55μg/L,批内和批间变异系数(CV%)分别为7.1%和11.7%,平均回收率为103.7%;双标记PGⅠ/PGⅡ-TRFIA与PGⅠ-ELISA法、PGⅡ-ELISA法的测定结果高度相关,具有较好的一致性,相关系数分别为0.9426和0.9396.检测300例健康人员的PGⅠ为(157.3±51.0)μg/L,PGⅡ为(10.6±5.9)μg/L,PGⅠ/PGⅡ比值为(14.8±4.3)μg/L.PGⅠ的正常参考值范围在55.3～259.3μg/L之间,PGⅡ正常参考值为<23μg/L,PGⅠ/PGⅡ>6.双标记PGⅠ/PGⅡ-TRFIA方法的研究在国内外尚未见报道,是一种灵敏、简便、快速、经济并可用于大批量样品筛查的方法,有利于各种胃病的大规模普查筛选及患者病程监测.

C肽与胰岛素双标记时间分辨荧光免疫分析法的建立及初步临床应用

建立钐(Sm3+)标记检测C肽(C-peptide)及铕(Eu3+)标记检测胰岛素(insulin)的双标记时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA),并初步尝试检测人血C肽以及胰岛素含量.将抗C肽单克隆抗体(Biodesign No.E54094M)与抗insulin单克隆抗体(BiodesignNo.E86306M)混合包被96孔板,然后用Sm3+标记抗C肽单克隆抗体(Medix No.9103),Eu3+标记抗insulin单克隆抗体(Biodesign No.E86802M),运用双抗体夹心一步法建立C肽/胰岛素双标记时间分辨免疫荧光分析法.结果显示:C肽分析灵敏度为0.2μg/L,线性范围为0.5～22μg/L,平均回收率达到99.6%,分析内和分析间变异系数分别为4.6%～6.0%和5.1%～7.6%.胰岛素分析灵敏度为0.8 mU/L,线性范围为3.6～180 mU/L,平均回收率为99.4%,分析内和分析间变异系数分别为3.7%～6.0%和5.1%～8.0%.C肽/胰岛素双标记检测试剂与PerkinElmer公司对应的单标记进口试剂盒分别同时测定血清样本200份,检测结果高度相关,具有较好的一致性,相关系数分别为0.98与0.99.总之,自建C肽/胰岛素双标记时间分辨荧光免疫分析方法的性能均可以达到临床检测要求,有望替代现有国内外较为昂贵的单标记试剂,可用于胰岛素分泌不足导致的糖尿病诊断及糖尿病的大规模普查筛选.

固相时间分辨荧光免疫标记技术研究

通过固相时间分辨荧光免疫分析双功能螯合剂 4 ,7 二氯磺基苯 1,10菲罗啉 2 ,9 二羧酸标记抗 乙型肝炎表面抗体 (HBsAb)IgG实验 ,对于BCPDA标记蛋白质的方法进行了研究。结果表明 :BCPDA在相对温和条件下能与蛋白质反应 ,反应后蛋白质的相对生物活性高于 78% ,标记比为 2 3～ 5 5 ,蛋白回收率达6 0 %以上。在一定条件下与铕离子形成稳定的BCPDA Eu3 + (HBsAb)IgG标记物。利用自建的分析方法 ,测定了标记过程的有关参数。并对标记物的某些光学特性进行了研究。

甲胎蛋白与CA19-9双标记时间分辨荧光免疫分析法的建立

目的建立钐(Sm3+)标记抗甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体(单抗)和铕(Eu3+)标记抗糖类抗原19-9(CA19-9)单抗的双标记时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)法。方法将抗AFP单抗与抗CA19-9单抗混合包被96孔板作为捕获抗体,用Sm3+标记抗AFP单抗、Eu3+标记抗CA19-9单抗作为检测抗体,建立同步检测AFP/CA19-9的TrFIA法。结果建立的TrFIA法检测AFP/CA19-9的灵敏度分别为0.3 ng/mL和2.5 U/mL。AFP分析内和分析间变异系数(CV)分别为2.6%～5.9%和4.3%～8.1%,CA19-9分析内和分析间CV分别为4.9%～5.6%和5.0%～6.3%。分别用建立的TrFIA法与Perkin-Elmer公司解离增强镧系荧光免疫分析(DELFIA)法同时测定血清样本,两法AFP与CA19-9的相关系数分别为0.99与0.98。结论建立的同步检测AFP与CA19-9的TrFIA法灵敏、简便、准确,有助于消化道肿瘤和睾丸癌等的辅助诊断。

应用高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱联用技术研究部分水解蛋白婴幼儿奶粉中的标记物

目的比较部分水解蛋白的婴幼儿奶粉和普通婴幼儿奶粉的指纹图谱,寻找具有潜在甄别意义的标记物,以利于有效区分含有部分水解蛋白的婴幼儿奶粉和普通婴幼儿奶粉。方法采用高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱(HPLC-Q-TOF-MS)联用技术,对1个含水解蛋白的婴幼儿奶粉和17个普通婴幼儿奶粉进行分析,将获得的指纹图谱,用计算机软件进行比较分析,寻找特征标记物。再采用液质联用技术,对验证样品进行特征标记物的可靠性验证。结果部分水解蛋白的婴幼儿奶粉和普通婴幼儿奶粉共有36个成分有统计意义,从中筛选出2个成分进行验证,从部分水解蛋白婴幼儿奶粉的验证样品中均可发现,普通婴幼儿奶粉均未发现。结论应用HPLC-Q-TOF-MS联用技术作为研究含部分水解蛋白婴幼儿奶粉中标识成份的工具,具有较好的重复性与精度,筛选得到的2个成分均有可能是潜在的部分水解蛋白婴幼儿奶粉标记物。

双标记AFP及Free-β-HCG时间分辨荧光免疫分析法的建立

目的:研制能同时检测人血清AFP和Free-β-HCG的双标记时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)试剂盒。方法:铕(Eu3+)标记抗AFP单克隆抗体,用钐(Sm3+)标记抗Free-β-HCG单克隆抗体,采用双抗体夹心法建立AFP/Free-β-HCG双标记TrFIA试剂,对试剂的各项性能指标进行评价。结果:AFP分析灵敏度为0.1U/ml,分析内和分析间的精密度分别为1.2%～5.9%和2.8%～6.3%,检测试剂的测量范围为(0.1～500)U/ml;Free-β-HCG分析灵敏度为0.25ng/ml,分析内和分析间的精密度分别为1.5%～6.2%和3.5%～5.6%,检测试剂的测量范围为(0.25～200)ng/ml。孕妇血样用本试剂盒与进口的同类试剂盒同时检测,AFP和Free-β-HCG的相关系数分别为0.987、0.968,具有较好的一致性。结论:自制AFP/Free-β-HCG双标记TrFIA试剂盒的各项性能指标均能达到临床检测要求,可替代国外同类产品。

利用时间分辨荧光免疫分析技术进行肺癌标记物检测

肺癌是目前全世界发病率和死亡率最高、预后最差的恶性肿瘤之一，严重影响着人类的健康和生存。肺癌标记物在早期肺癌中的异常表达已成为肺癌早期诊断研究领域中最有前景的科学探索。但由于现有检测方法灵敏度较差，使广大肺癌患者可能错失了早期发现的机会，我们利用时间分辨荧光免疫分析技术进行肺癌标记物的血清含量检测，与传统肺癌标记物检测方法相比较，具有较高精密度和准确度，可在极短时间内实现对大量病人高通量、高灵敏度的肺癌标记物快速检测，满足大范围筛查早期肺癌的需要，报道如下。

检测β-CTX和N-MID水平的双标记时间分辨免疫荧光分析方法的建立和评价

目的:研制一种检测β胶联降解产物(β-CTX)和骨钙素N端中分子片段(N-MID)水平的双标记时间分辨免疫荧光分析方法(TRFIA)并评价其检测性能。方法:将抗β-CTX和N-MID的4E5和2B7单克隆抗体(MAb)作为包被抗体包被在96孔培养板,采用铕离子(Eu^(3+))和钐离子(Sm^(3+))分别标记2G6和5A3 MAb作为检测抗体,建立双抗体夹心TRFIA分析法并制备成试剂盒。通过试剂盒的灵敏度、准确度(稀释回收率)、特异性、精密度、稳定性和临床样本比对等实验评价其检测性能。结果:制备的双标记TRFIA试剂盒对β-CTX的检测灵敏度为0.025μg·L^(-1),线性范围为0.025~5.000μg·L^(-1),对N-MID的检测灵敏度为0.5μg·L^(-1),线性范围为0.5~200.0μg·L^(-1)。β-CTX平均稀释回收率为102.13%,N-MID平均稀释回收率为103.02%,与其他常见骨检测指标无明显交叉反应,特异性较强。β-CTX批内变异系数(CV)为5.81%~7.82%,批间CV为5.97%~8.02%;N-MID批内CV为6.05%~8.32%,批间CV为6.14%~8.56%;TRFIA试剂盒可在4℃稳定保存6个月,37℃稳定保存7 d。结论:建立的双标记TRFIA方法具有高灵敏度、高特异度、高准确率和方便快捷等优点,适用于大批量临床样品的检测。

时间分辨荧光免疫法对乙型肝炎标志物少见模式的应用

目的探讨时间分辨荧光免疫技术(TRFIA)对乙型肝炎标志物少见模式的应用价值并进行评价。方法用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)法检测14476份临床标本的乙型肝炎标志物并对其模式进行统计分析。结果 14476份乙型肝炎检测结果,共有乙型肝炎标志物模式共有17种,其中常见模式9种,占95.88%(13879/14476),罕见模式8种,占4.12%(597/14476),HBsAg和HBsAb同时阳性占所有罕见模式的87.94%(525/597),而HBsAg阴性HBeAg阳性占所有罕见模式的11.73%(70/597)。结论时间分辨荧光免疫技术能有效检测出乙型肝炎标志物罕见模式,对临床诊断和治疗起着重要作用。

抗心磷脂抗体IgG和IgM双标记时间分辨荧光免疫分析法的建立和应用

目的 评价新建立的双标记时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA法）检测抗心磷脂抗体（ACA）IgG和IgM的临床应用价值。方法 以心磷脂抗原（含β2糖蛋白Ⅰ段）包板,以稀土元素铕离子（Eu3＋）和钐离子（Sm3＋）分别标记抗人IgG抗体和抗人IgM抗体建立双标记TRFIA法。收集510例自身免疫性疾病患者（硬皮病24例、肾病综合征36例、强直性脊柱炎16例、脑梗死117例、狼疮性肾炎33例、干燥综合征63例、系统性红斑狼疮153例、类风湿关节炎70例）和50名健康献血者的血清标本,采用双标记TRFIA法测定ACA-IgG型抗体和ACA-IgM型抗体的临床阳性率和特异度。评估双标记TRFIA法检测高、中、低值样本的精密度。将3份已知浓度血清标本作倍比稀释,计算ACA-IgM型抗体和ACA-IgM型抗体的回收率。与酶联免疫吸附试验（ELISA法）的结果进行比对,分析双标记TRFIA法与ELISA法检测结果的一致性和稳定性等。结果 双标记TRFIA法检测ACA-IgG型抗体和ACA-IgM型抗体标准曲线的R2值分别为0.999、0.993,荧光强度值与样本浓度呈线性相关。ACA-IgM型抗体高、中、低3个浓度的批内变异系数（CV）分别为1.31%、2.82%、4.14%,批间CV分别为2.29%、4.08%、6.97%;ACA-IgG型抗体高、中、低3个浓度的批内CV分别为1.21%、3.18%、4.61%,批间CV分别为2.26%、3.93%、7.34%。双标记TRFIA法检测ACA-IgM型抗体和ACA-IgG型抗体的灵敏度均为0.1U/mL,特异度均为98.00%（49/50）。ACA-IgG型抗体回收率为95.11%~106.14%,ACA-IgM型抗体回收率为96.04%~106.54%。硬皮病、肾病综合征、强直性脊柱炎、脑梗死、狼疮性肾炎、干燥综合征、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎患者ACA-IgG型抗体阳性率依次为16.67%、2.78%、7.14%、3.42%、15.15%、4.76%、7.84%、8.57%,ACA-IgM型抗体阳性率依次为4.17%、11.11%、14.29%、3.42%、27.27%、3.17%、8.50%、10.00%。双标记TRFIA法检测ACA-IgM型抗体和ACA-IgG型抗体的结果与ELISA法均呈正相关（R2值分别为0.928、0.924,P值均〈0.05）。双标记TRFIA法检测ACA-IgM型抗体和ACA-IgG型抗体的荧光强度值分别下降14.7%和15.8%,ELISA法检测ACA-IgM型抗体和ACA-IgG型抗体的光密度值分别下降37.6%和33.9%。结论 双标记TRFIA法同时检测ACA-IgG型抗体和ACAIgM型抗体具有效率高、灵敏度高、特异性强、检测范围宽和稳定的优点,其临床应用价值高,应用前景广阔。

常波长和飞行时间模式下中子散射的散射矢量分辨率分析

讨论了中子散射实验中散射矢量分辨率问题,并根据目前谱仪通常的角度分辨和波长分辨参数,给出了常波长模式和飞行时间模式的分辨率曲线,并比较了不同模式的优缺点。分析表明,对于低q范围(<0.4nm-1)散射实验测量,飞行时间模式的分辨率更好;对于高q范围的中子散射测量,常波长模式更适合。

TNF-α/hs-CRP双标记时间分辨荧光免疫法用于脓毒症早期筛查诊断的研究

目的建立一种双标记时间分辨荧光免疫法(TRFIA)用于定量检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和超敏C-反应蛋白(hs-CRP)水平。方法将抗TNF-α和hs-CRP单克隆抗体包被在96孔板,制备铕(Eu3+)和钐(Sm3+)检测抗体偶联物,建立双抗体夹心TRFIA法并组装成试剂盒,评价此试剂盒的灵敏度、线性范围、加标回收率和各项检测性能。结果建立了TRFIA检测血清TNF-α和hs-CRP水平的新方法并组装成试剂盒,此试剂盒对TNF-α检测的线性范围为0~100 ng/L,灵敏度为0.05 ng/L,对hs-CRP检测的线性范围为0~100 mg/L,灵敏度为0.02 mg/L;对TNF-α检测的加标回收率92.00%~107.00%,对hs-CRP检测的加标回收率95.00%~106.82%,与其他常见的血清干扰物质无明显的交叉反应;对TNF-α检测的批内CV 4.57%~9.24%,批间CV 5.13%~9.27%;对hs-CRP检测的批内CV 3.57%~7.69%,批间CV 6.07%~10.00%;试剂盒能够在4℃稳定保存6个月,37℃下可稳定保存7 d以上。TNF-α的检测阈值为0.44 ng/L,hs-CRP的检测阈值为1.41 mg/L。该试剂盒检测判定结果与临床情况相一致,符合率100%。结论双标记TRFIA法可定量检测TNF-α和hs-CRP水平,具有灵敏度和准确度高、特异性强、方便快捷等优点,可为脓毒症临床样品的早期筛查、疗效评价和预后评估提供一种新的检测方法。

荧光标记聚苯乙烯微球的激光捕获及其原位稳态和时间分辨荧光光谱研究

本工作设计研制了一套激光捕获与原位稳态及时间分辨荧光光谱检测系统,该系统将激光捕获技术与稳态及时间分辨荧光光谱检测技术相结合,实现了对亚微米级微粒的原位稳态及时间分辨发光性质研究.利用研制的仪器研究了荧光标记聚苯乙烯微球的激光捕获过程、以及捕获微粒的原位稳态及时间分辨荧光光谱.本工作为单个纳米粒子发光性质的研究开辟了一条新的途径.

时间分辨荧光免疫分析用标记试剂——N^1-(对-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸钐钠的研制

时间分辨荧光免疫分析是一种利用镧系元素(多用铕、钐和铽离子)作标记物的免疫分析。镧系元素螯合物在激发光作用下,产生发射光,其激发光与发射光之间有很宽的Stokes位移,发射光谱峰很窄,具有不同的最大发射波长,如铽(Tb3+)、铕(Eu3+)和钐(Sm3+)分别为544、613和643nm;其?..

一种新型铽荧光配合物的合成及其在生物标记与时间分辨荧光测定中的应用

基于稀土配合物长寿命荧光特性而发展起来的高灵敏度时间分辨荧光生化分析技术已经在临床检测与生物技术领域得到了广泛的应用，理想的稀土荧光标记物应该具有如下几个特征：（1）配合物分子与稀土离子之间的配位足够稳定；（2）荧光较强；（3）具有良好的水溶性；（4）荧光寿命长；（5）易于生物分子标记。但现有的理想稀土配合物数量十分有限，严重限制了时间分辨荧光生化分析技术的发展。本研究设计、合成了一种新型铽（Ⅲ）荧光配合物，并探讨了其在生物标记及时间分辨荧光测定中的应用。

铕标记抗原、激光时间分辨荧光免疫分析尿中白蛋白

放射免疫分析法(RIA)将免疫反应的特效性与放射性测量的灵敏性相结合,是当今最广泛采用的方法之一。但RIA药盒使用寿命受放射性同位素半衰期的限制以及操作放射性对人体和环境可能导致某些危害,促使人们力图改善以非放射性物质标记的其它免疫分析法的灵敏度。1979年Soini和Hemmila提出的时间分辨荧光免疫分析(TR—FIA),以稀土螯合物作标记物连接到抗体或抗原上,免疫反应完成后,用时间分辨技术测荧光,很容易将稀土螯合物的荧光与背景荧光压分开。由于TR—FIA能达到甚至超过RIA灵敏度,标记物没有辐照分解之患,测定动态范围广,方法简便快速,

用动脉自旋标记法行脑血管的时间分辨性选择性数字减影MR血管成像

目的证实动脉自旋标记MR血管成像技术能覆盖全部的脑血管系统并提供具有透明背景和时间分辨性的血流动力学及血管特异性信息。

Eu^3＋标抗原盐酸克伦特罗的时间分辨荧光免疫检测

采用时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)建立简便、快速、灵敏的盐酸克伦特罗(clenbuterol hydrochloride,CBL)检测方法。以自制盐酸克伦特罗单克隆抗体包被96孔微孔板作为固相抗体,Eu3+标记抗原与样品中的CBL竞争结合抗体,建立直接竞争荧光免疫分析体系。猪尿、组织样品添加回收率实验表明:方法灵敏度为0.02μg/L,样品回收率为91%～101%,与沙丁胺醇、莱克多巴胺等结构类似物的交叉反应率均小于1%。建立盐酸克伦特罗铕标抗原直接竞争时间分辨免疫检测方法,方法灵敏度高、特异性强,且操作简单,完全可以满足现有实际检测需求。