重组人可溶性CD14在昆虫细胞表达系统中的表达

BAC TO BAC 杆状病毒表达系统是一种快速、高效、便捷的表达系统。将人可溶性CD14(sCD14)基因克隆入pFASTBAC1转移质粒中 ,重组质粒转化DH10BAC 感受态细胞 ,目的基因通过同源重组插入BacmidDNA中 ,后者转染sf2 1昆虫细胞获得重组杆状病毒。利用重组蛋白C 末端的 6×His·Tag ,经TALON金属螯合色谱将重组病毒感染昆虫细胞获得的无血清培养上清一步纯化得到重组蛋白 ,计算表明从 1L培养基中可纯化到约 8mg纯度大于95 %的重组sCD14蛋白 ,免疫印迹结果表明重组蛋白具有与抗 6×His单抗和抗CD14单抗结合的抗原性。凝胶迁移实验和细胞活性实验表明重组sCD14蛋白能在体外与LPS结合 ,并能增强LPS诱导THP

蜱IgG结合蛋白的昆虫细胞表达及结合IgG特性分析

蜱吸食宿主大量血液，其中宿主血液中IgG分子能穿过蜱肠道，进入血淋巴，且能保持其活性。为逃避宿主免疫攻击，蜱唾液腺分泌一种免疫球蛋白结合蛋白（ImmunoglobulinGbindingprotein，IGBP），与蜱体内的宿主IgG结合，抑制宿主IgG对蜱的损害，是蜱唾液腺重要的功能分子，也是抗蜱疫苗候选分子。镰形扇头蜱是我国南方的优势蜱种，其唾液腺免疫球蛋白结合蛋白（RH．IGBP）被鉴定为抗蜱免疫保护性抗原，为进一步了解其生物学功能，本研究应用杆状病毒表达系统，构建出重组杆粒Bacmid．IGBP，并在昆虫细胞中表达出真核重组蛋白RH-IGBP，经免疫荧光实验鉴定和Westernblot分析，重组蛋白大小为23kDa，与预期一致。重组蛋白经纯化，利用ELISA方法，研究重组蛋白与不同哺乳动物宿主（兔、猪、牛羊、鼠、犬）和人的IgG结合能力，发现RH·IGBP与不同宿主IgG结合能力不同，与兔、猪的IgG有明显结合能力。对来自兔源IgG不同酶切片段F（ab’）2和Fc与RH．IGBP结合特性分析表明，蜱IgG结合蛋白主要识别部位是IgG的F（ab’）2片段。这些结果初步揭示了蜱IgG结合蛋白的作用机制和特点。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展

真核细胞大部分生命活动是通过复合体催化的。因此,系统了解这些复合体的生物学功能,将在健康和疾病方面具有重要意义。由于内源性复合体存在低丰度和异质性特点,因而直接提取复合体存在一定的困难。杆状病毒-昆虫细胞表达系统可成功表达复合体,为研究复合体的结构和功能提供新的手段。综述近年来利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行蛋白质复合体结构和功能研究的进展。

Tat-Vp3融合蛋白在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达与纯化及其促凋亡功能的研究

目的:采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统获取可溶性His-Tat-Vp3融合蛋白,并观察其对细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建重组质粒pFastBac^(TM)1-TAT-VP3,转化DH10Bac感受态细胞,获得杆状病毒质粒,转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒,纯化并扩增该病毒。用最适滴度的病毒刺激Sf9细胞以诱导His-Tat-Vp3蛋白表达,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定,获得分子质量约21 kDa的融合蛋白。采用MTT实验与流式细胞技术检测500、1 000、2 000 nmol/L的融合蛋白抑制肿瘤细胞(HeLa细胞)增殖及促凋亡的活性。结果:通过昆虫表达系统成功表达及纯化出Tat-Vp3融合蛋白,其中1 000、2 000 nmol/L融合蛋白组可显著抑制肿瘤细胞的增殖,并提高细胞的凋亡率。结论:成功构建His-TAT-VP3融合蛋白昆虫系统表达载体,在昆虫表达系统中可诱导性可溶性高表达,所获融合蛋白能显著抑制HeLa细胞的增殖,并促进其凋亡。

世界首创用昆虫细胞表达重组猪卵泡刺激激素

群马大学生理活性物质中心助教授加藤幸雄小组用昆虫细胞表达重组猪卵泡刺激激素(FSH),确认重组FSH具有与天然FSH相同的生物活性。据说目前有用人、牛生产重组FSH的,但是用猪生产重组FSH是世界首创。得到了纯度高的FSH。它除对卵泡刺激激素的机能和作用机制的分析有用外,还能应用于猪体外受精系统的研究。于10日2～8日在新泻召开的日本畜产学会上发表了这项成果。 群马大学与日生研、大阪府立大学、东北农业试验场、冈山大学合作,在一个杆状病毒载体上插入了FSH的α链和β链两个基因,使昆虫细胞Tn5感染。

昆虫细胞表达功能性HLA-DR4

瑞士 Hoffmam-la Roche 公司用昆虫细胞表达人二级主要组织适合基因复合体（MHC）抗原的HLA-DR4分子,使昆虫细胞发挥人的抗原提示细胞机能。美国 Roche 公司副经理兼生物技术研究组组长 Michael Steinmetz 在9月19日东京召开的第二届罗希讨论会上发表了其概要。研究详情近期在 Journ-

非洲猪瘟病毒p54蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫原性分析

非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白由晚期基因E183L编码,是主要的结构蛋白之一。为了获得免疫原性强的p54蛋白,本研究将E183L基因克隆至pFastBac1载体中,取1μg重组质粒转座DH10Bac感受态细菌,经三轮蓝白斑筛选后,获得重组Bacmid-p54。将提取的Bacmid-p54质粒DNA转染Sf9细胞,出现明显病变后,收获细胞培养上清,在正常Sf9细胞中传三代,获得的杆状病毒命名为rBac-P54。利用SDS-PAGE检测rBac-P54感染后昆虫细胞的蛋白表达情况,并通过间接免疫荧光(IFA)和Western-blot鉴定p54蛋白的免疫原性。结果显示,在感染的Sf9细胞中,p54蛋白能获得高效表达,并可被ASFV阳性血清特异性识别。这表明杆状病毒系统表达的p54蛋白具有良好的免疫原性,为后续开展非洲猪瘟血清学诊断和p54功能研究奠定基础。

猪圆环病毒2型ORF2基因在昆虫细胞中的表达及其特性

利用BactoBac杆状病毒表达系统将圆环病毒2型的ORF2全基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTM1中,获得重组转移载体pFastOFR2,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用,经蓝白菌落筛选得到含ORF2基因的重组穿梭载体Bac.ORF2,以脂质体介导的方法将重组穿梭载体转染sf9细胞,获得重组病毒,命名为Ac.ORF2。间接免疫荧光分析表明,PCV2阳性血清能使Ac.ORF2感染的sf9昆虫细胞呈强的荧光着色;SDSPAGE与Westernblotting分析可见大小约为28kD的特异性带,表明Ac.ORF2在sf9细胞中成功表达了PCV2ORF2蛋白。将该表达蛋白纯化并经磷钨酸负染后,通过电镜观察可见形态与PCV2病毒粒子相似的病毒样颗粒(VLPs),其中某些颗粒由于中心浓染而似空衣壳,其直径也为17nm左右。

猪圆环病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中表达形成病毒样颗粒的研究

本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)PCV2b的ORF2基因插入供体质粒pFastBacTMⅠPPH启动子控制下的多克隆位点,构建的质粒转化DH10BAC感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-cap。将rBacmid-cap转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,间接免疫荧光试验证明目的蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得了表达。将该重组杆状病毒感染HighFiveTM细胞后,用Western blot在细胞培养上清中检测到了目的蛋白,并于d 5达到表达高峰。电镜观察结果显示上清中的目的蛋白可以装配成直径约为17 nm的病毒样颗粒。病毒样颗粒在培养上清中的大量存在,为目的蛋白进一步的分离和纯化提供了便利,也为PCV2基因工程疫苗的产业化奠定了基础。

重组人干细胞因子在昆虫细胞中的高效表达

含信号肽的可溶性人干细胞因子（ｈＳＣＦ）ｃＤＮＡ 基因重组于杆状病毒转移载体ｐＶＬ９４１ 中，重组转移载体ｐＶＬ９４１ＳＣＦ与野生型苜蓿夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ 共转染草地夜蛾细胞Ｓｆ９ 后，通过体内同源重组构建了重组病毒ＡｃＮＰＶＳＣＦ。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交表明重组病毒基因组中含有ｈＳＣＦ基因片段。重组病毒感染单层Ｓｆ９ 细胞后，表达产物分泌到胞外培养液中。用ＭＴＴ 比色法和ＴＦ１ 细胞株测定表达产物与ＩＬ３ 的协同效应，测得感染重组病毒的培养细胞第三天表达量为１９７０ ｕｎｉｔｓ／ｍ Ｌ培养液。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析可见分子量为１８ ×１０３ 、２０ ×１０３ 和２２ ×１０３ 三条带。

狂犬病病毒糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性分析

目的 :利用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统对狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)基因进行克隆、表达、纯化,并对重组RVG进行免疫学特性鉴定。方法:参照Gen Bank收录的狂犬病病毒CVS-11株RVG基因序列,设计特异性引物,扩增目的基因。RVG基因经Bam HⅠ/KpnⅠ双酶切后定向克隆到p Fast Bac-GP67B载体上,阳性重组转座质粒进一步转化E.Coli DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后获得重组穿梭载体r Bacmid-RVG,将其转染至对数生长期的Sf-9昆虫细胞,进行重组RVG的真核表达。His-Trap HP纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。重组RVG免疫小鼠,检测其免疫原性和血清中和活性。结果:用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统表达并纯化了重组RVG,分子量约58 000。经重组RVG免疫后的小鼠血清具有中和活性。结论:重组RVG具有天然RVG的活性,为进一步研制亚单位疫苗及制备筛选中和抗体奠定了基础。

抗对硫磷单链抗体在昆虫细胞中的表达及活性鉴定

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,在Sf9昆虫细胞中表达抗对硫磷单链抗体,并评价该重组抗体sc Fv-4C6的分子识别活性。以分泌能特异性识别对硫磷的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C6为RNA来源,采用RT-PCR方法扩增抗体的重链和轻链可变区基因,经重叠延伸PCR方法串联拼接获得单链抗体基因片段(sc Fv-4C6)。构建包含目的片段的重组杆粒Bacmidsc Fv-4C6,转染Sf9细胞表达目的蛋白,采用免疫印迹法(Western blotting)检测表达产物,间接竞争酶联免疫吸附(ic-ELISA)法评价产物的生物活性。结果表明:sc Fv-4C6基因片段拼装正确,成功转染Sf9细胞,并在转染后72 h表达量最高,表达的单链抗体大小为28.3 k D;表达产物能特异性识别对硫磷,IC50值为7.9 ng/m L,对甲基对硫磷和杀螟硫磷分别有12%和1.8%的交叉反应率,与亲本单克隆抗体的识别性能相似。该研究表明,具有生物活性的抗对硫磷单链抗体sc Fv-4C6可在昆虫细胞中成功得到表达。

犬干扰素α2与犬白蛋白融合基因在昆虫细胞中的表达与活性分析

本研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达具有生物活性的犬白蛋白-犬干扰素α2(albumin-CaIFN-α2)。将蜂素信号肽(HBM)、犬血清白蛋白(Alb)与犬干扰素α2的融合基因经密码子优化后,连接至转移载体pFastBac1中,获得了重组pFastBac1-HBM-Alb-CaIFN-α2,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经过三次蓝白斑筛选纯化,得到的重组穿梭质粒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2转染Sf9细胞,72 h后可观察到明显的细胞病变。用第三代重组杆状病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2感染Sf9昆虫细胞,感染3 d后,收获昆虫细胞和细胞培养物,间接免疫荧光(IFA)结果显示,重组杆状病毒感染的细胞呈现绿色荧光;Western blot检测结果显示,在约90 ku左右可观察到特异性条带,证实重组Alb-CaIFN-α2能够在昆虫细胞中表达。利用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测重组Alb-CaIFN-α2的抗病毒活性,结果显示重组Alb-CaIFN-α2的活性为1.70×10 6 U·mL^-1,为进一步研究新型犬用干扰素制品奠定了试验基础。

H5N1高致病性禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达

目的:扩增高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因,并进行真核表达。方法:抽提毒株A/Jiangsu/08-6基因组RNA,反转录为cDNA,用特异性引物扩增HA基因。HA经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆到pFastBac-GP67B载体上,筛选出阳性重组转座质粒pFastBac-GP67B-HA,并将其进一步转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定后,获得重组穿梭载体(rBacmid-HA),再通过CellfectinⅡ试剂转染rBacmid-HA至对数生长期的sf9昆虫细胞,进行目的蛋白的真核表达。分别用SDS-PAGE、Western blot、血凝试验以及质谱分析对其进行鉴定。结果:HA基因在sf9细胞表达的蛋白分子量约70 000。血凝试验表明重组HA蛋白可使鸡红细胞发生凝集。质谱分析鉴定该重组蛋白为HA蛋白。结论:重组HA蛋白具有天然HA蛋白的活性,为亚单位疫苗的研制及中和抗体的筛选奠定了基础。

密码子优化的鸭坦布苏病毒E基因在昆虫细胞中的表达

为了使鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)的E蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统中高效表达,本研究将DTMUV的E基因按照昆虫细胞偏嗜性密码子进行了优化,合成了基因optiE,并将其插入到pFastBac HT载体上,得到质粒pFastBac-optiE。将该质粒转化DH10BAC感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组转座子rBacmid-optiE。将rBacmid-optiE转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,间接免疫荧光试验和Western blot方法都证实目的蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得了表达。本研究为进一步研究DTMUV E蛋白的结构与功能奠定了基础。

汉坦病毒G2糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其在免疫诊断中的应用

目的构建汉坦病毒(HV)Z10株包膜糖蛋白G2基因的重组表达载体,探索其在昆虫细胞中的表达及在免疫荧光诊断中的应用。方法以质粒pUCmZ10M为模板设计引物,用聚合酶链反应(PCR)扩增Z10株G2基因片段,将G2片段克隆入pUCmT质粒载体,碱法提取质粒pUCmZ10G2,酶切后将回收片段插入杆状病毒转移载体pFastBacHTa,构建重组体pFastBacHTaZ10G2,重组体转化感受态细胞E.coliDH10Bac后,经2轮筛选,提取重组质粒转染昆虫细胞sf9,并用间接免疫荧光技术检测表达的G2蛋白。结果获得含有编码HVZ10株的包膜糖蛋白G2基因的重组质粒,转染昆虫细胞表达出G2蛋白,与肾综合征出血热(HFRS)阳性血清反应,昆虫细胞内呈现特异性环状荧光。检测40份HFRS血清,与全病毒细胞抗原片的符合率为95%。结论成功构建HVZ10株包膜糖蛋白G2基因的表达载体,并在昆虫细胞中表达。可利用重组G2蛋白检测HV感染。

经密码子优化的猪Ficolin α在昆虫细胞的表达及其体外抗病毒作用初步分析

利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达具有天然构象的猪Ficolinα。首先构建重组穿梭质粒rBacmid-Ficolinα,转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-Ficolinα;通过Image J软件对优化表达的Western blot图片进行灰度分析确定较佳表达条件;纯化目的蛋白质后,进一步评价其体外抗病毒活性。Western blot结果显示以7.5MOI接种量感染的sf9细胞在96h时获得了较高的表达,同时获得的重组猪Ficolinα具有抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活性。猪Ficolinα在sf9昆虫细胞中获得成功表达,且具有良好的抗PRRSV活性。本研究可以为猪Ficolinα的抗病毒活性及作用机制研究提供物质基础。

HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的形成

目的 在昆虫细胞中同时表达HCV的核心蛋白C和包膜蛋白 (E1、E2 )以形成病毒样颗粒 (VLP)。方法 利用PCR技术得到HCV的核心蛋白和包膜蛋白基因 ,用基因重组技术分别构建表达HCVC、E1和E2蛋白的重组杆状病毒 ,用SDS PAGE电泳分析HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达。电镜观察昆虫细胞内VLP的形成。结果 得到了能表达HCVC蛋白和同时表达E1、E2蛋白的重组杆状病毒reBV/C和reBV/E1、E2。reBV/C和reBV/E1、E2共感染的昆虫细胞同时表达了C、E1和E2蛋白 ,分子量分别为 2 0kD ,35kD和 6 6kD。电镜观察到表达HCV结构蛋白的昆虫细胞质中存在大量的直径为 4 0～ 6 0nm的VLP ,对照细胞无此结构。结论 在昆虫细胞中表达的HCVC。

WSSV ie1的野生型和突变体在昆虫细胞中的表达及其蛋白纯化

对虾白斑综合征（White Spot Syndrome,WSS）是由对虾白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）引起的,该病毒是目前世界范围内对虾养殖业的主要病原,它感染的宿主种类多,分布范围广,传播速度快。对虾被感染后,3—10d内累积死亡率可达90%—100%[1,2],目前尚无有效的预防和治疗该病的药物，给对虾养殖业造成巨大损失。

水稻矮缩病毒外壳蛋白基因S8在昆虫细胞中的表达

将水稻矮缩病毒 (RiceDwarfVirus,RDV)外壳蛋白基因S8克隆到杆状菌毒转移载体 pVL1 393中 ,重组转移载体 pVL1 393 S8与线性杆状病毒RP2 3.LacZ共转染草地夜蛾细胞sf9,经过细胞体内同源重组、PCR筛选得到重组病毒RP2 3 S8。重组病毒RP2 3 S8感染sf9细胞后 ,收集细胞 ,并进行SDS PAGE及Western blot检测。结果表明 ,S8基因在昆虫细胞中成功表达 ,且在感染后