猪圆环病毒2型Rep蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达和纯化

为了在Sf9昆虫细胞中表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白,试验以PCV-2毒株(PCV-2b)的DNA为模板扩增ORF1基因,将ORF1基因插入到转移载体质粒pQB3s上,构建重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep,将重组质粒与杆状病毒表达载体qBac-ⅢG共同转染Sf9昆虫细胞,获得P0代重组杆状病毒,经连续传代获得P1、P2、P3代重组杆状病毒,将P3代重组杆状病毒接种到Sf9昆虫细胞中进行悬浮培养,收集细胞并利用镍柱纯化重组表达的蛋白,通过荧光显微镜观察感染重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞中的荧光量,通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果表明:经PCR鉴定在945 bp处出现特异性条带;通过荧光显微镜观察,在转染后第1天就出现绿色荧光,第4~5天出现大量绿色荧光,P2、P3代重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞及P3代重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞后在第4~5天出现大量绿色荧光;P2、P3代重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞的细胞裂解液及纯化的重组Rep蛋白,通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定在约38 ku处出现目的条带。说明试验成功构建出重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep及重组杆状病毒,构建的重组杆状病毒可以在悬浮培养的Sf9昆虫细胞中表达重组蛋白Rep。

昆虫细胞Sf9在四种生物反应器中的培养

昆虫细胞表达系统已广泛的应用于表达各种重组蛋白,研究昆虫细胞Sf9分别在4种生物反应器:转瓶、摇瓶、Bellocell反应器、发酵罐中进行悬浮培养.转瓶、摇瓶、Bellocell和发酵罐的细胞接种密度都是5×105/mL.对细胞数量、葡萄糖浓度以及主要代谢产物乳酸、氨的浓度进行检测.昆虫细胞经转瓶和摇瓶培养,细胞密度达到最高分别为:5.5×106、7.3×106/mL,是起始密度的11倍和14.6倍.昆虫细胞经Bellocell和发酵罐培养,细胞密度达到最高分别为:8.01×106、1.52×107/mL,是起始密度的16.02倍和30.4倍.昆虫细胞经四种生物反应器中的悬浮培养之后,都达到了很高的密度,尤其是经发酵罐培养达到如此高密度,为高效大规模表达药物蛋白,奠定重要的基础.

猪圆环病毒2型DY株ORF2基因在Sf9昆虫细胞中的表达

本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。

Autotaxin在sf9昆虫细胞的表达及纯化研究

目的 通过sf9昆虫细胞表达人Autotaxin（ATX）,获得具有生物学活性的目的蛋白。方法 采用TRIzol法提取人的黑色素瘤细胞总RNA,通过RT-PCR获得人ATX基因,构建p Fast BacTMHTA-ATX,Bacmid-ATX重组质粒,脂质体转染sf9昆虫细胞,收获重组ATX病毒;重组病毒侵染sf9昆虫细胞表达人ATX;通过His TrapTMHP和Hi Load 16/600 Superdex 200pg柱两部纯化获得目的蛋白并测定其磷脂酶D（lysophospholipase D,lyso PLD）活性。结果 用Bam H I和Xho I双酶切鉴定PCR产物及重组载体的正确性,重组病毒能够侵染sf9细胞表达人ATX,柱层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳纯度95%以上,每升表达液可得到纯化蛋白6mg,其明显具有溶血磷脂酶D（lysophospholipase D,lyso PLD）活性。结论 通过Bac-to-Bac表达系统构建的重组病毒杆粒能够感染sf9昆虫细胞,并正确表达具有生物学活性的人ATX,为开展ATX结晶与结构分析研究提供材料,为开发高效的ATX小分子药物抑制剂提供帮助。

人白血病抑制因子(hLIF)在昆虫细胞Sf9中表达

白血病抑制因子（LIF）是一种作用广泛的细胞因子,它促进小鼠白血病M1细胞分化并抑制其增殖,所以把它命名为白血病抑制因子。随着研究的不断深入,人们了解到它还具有抑制胚胎干细胞的分化,抑制脂蛋白脂酶的活性,促进骨吸收,引起血小板增加,刺激肝细胞合成急性反应蛋白,以及参与胚胎发育、促进神经肌肉的生长和维持垂体功能等作用。 本研究用PCR扩增pLXSN-hLIF中的LIF结构序列。

日本血吸虫钙网织蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及其活化树突细胞的初步分析

为获得在Sf9昆虫细胞中表达的日本血吸虫钙网织蛋白(Schistosoma japonicum calreticulin protein,SjCRT)并分析其活化小鼠骨髓来源树突状细胞的功能,将构建的重组杆状病毒转移载体pFastBacHTA-SjCRT转入DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒reBacmid-SjCRT,再转染到Sf9昆虫细胞,进行重组蛋白的表达。用Western blot和间接免疫荧光对表达蛋白进行鉴定。His柱亲和层析法纯化表达的蛋白,Westen blot鉴定纯化后的蛋白。从BALB/c小鼠产生骨髓来源的树突细胞mDCs,用纯化的重组SjCRT蛋白与mDCs共培养,流式细胞术检测mDCs细胞的表面分子MHCⅡ、CD40和CD86的表达。结果显示,在Sf9昆虫细胞中成功表达了SjCRT蛋白;纯化后的重组SjCRT蛋白既能被感染日本血吸虫42 d的兔阳性血清识别,也能被原核表达的重组SjCRT蛋白免疫鼠的血清所识别。流式细胞术结果显示,与对照组的相比,SjCRT蛋白刺激组mDCs细胞表面分子MHCⅡ和CD86的表达量显著增强(P<0.05)。可见,在Sf9昆虫细胞中表达的SjCRT蛋白能刺激小鼠骨髓来源树突细胞表型的成熟。

HCV核心和截短的包膜蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性

目的 :构建含 HCV全长核心基因和截短的包膜蛋白 E2基因的重组杆状病毒表达载体 ,研究其表达和抗原性。 方法 :以含 HCV全长 c DNA克隆的 p GEM- HCJ4质粒为模板 ,PCR扩增全长的 HCV核心抗原基因和截短的 E2基因片段 ,插入转座载体 p Fast Bac HTa构建重组转座质粒 p FB- CE2 t,转化 DH10 Bac大肠杆菌 ,获得重组杆状病毒穿梭质粒 Bacmid- CE2 t,以之转染昆虫 Sf9细胞进行外源基因的表达 ,并对其抗原性进行 EL ISA检测。 结果 :SDS- PAGE和 Western blot分析表明Bacmid- CE2 t在 Sf9细胞表达了 HCV C- E2蛋白 ,并能利用细胞内蛋白酶将其裂解为单独的 C蛋白和截短的 E2蛋白。纯化后的蛋白能分别与 HCV C蛋白、E2蛋白单抗以及慢性丙型肝炎患者血清反应。 结论 :HCV核心蛋白和截短的

mIL-4昆虫表达载体pIZT/V5-His的构建及其高效表达

目的:构建昆虫表达载体pIZT/V5-His的基础上,建立能稳定高效表达mIL-4的昆虫细胞系。方法:PCR体外扩增mIL-4,将目的基因mIL-4和昆虫表达载体pIZT/V5-His用EcoRI和XbaI做双酶切,通过T4 DNA连接酶构建成含mIL-4目的基因的表达载体pIZT/V5-His-IL4。采用脂质体法将重组DNA转染到生长良好的昆虫细胞Sf9中。转染后的第3天,用ELISA方法检测转染细胞的培养上清中分泌型蛋白mIL-4的含量。结果:转染后的昆虫细胞Sf9能产生大量的mIL-4,含量可达1 mg.L-1,明显高于对照组(0.003 mg.L-1)。结论:昆虫表达载体pIZT/V5-His可用于mIL-4的高效表达。

庚型肝炎病毒NS3蛋白在昆虫细胞中的表达

The recombinant GBV-C/HGV NS3 protein was expressed in Sf9 insect cells and analyzed by SDS-PAGE. A protein band about Mr 43810 was demonstrated on polyacrylamide gel electrophoresis and this protein amounted to more than 30% of the total cell proteins. Recombinant NS3 protein was purified by Ni-NTA column. Western blot showed that this recombinant protein could react with GBV-C/HGV RNA positive mixed sera. The recombinant GBV-C/HGV NS3 protein could be used to detect GBV-C/HGV infection and will supply material for study of structure and function of this protein.

截短的丙型肝炎病毒核心蛋白基因和绿色荧光蛋白基因在Sf9细胞中的融合表达

目的构建含截短的HCV核心蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的重组杆状病毒表达载体,探讨其在Sf9细胞中的表达和抗原性。方法用PCR法扩增截短的HCV核心蛋白基因片段(Ct)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,将其插入转座子载体pFastBac1,构建成重组表达载体pFastCt-EGFP,转化大肠埃希菌DH10Bac,获得重组杆状病毒穿梭质粒BacmidCt-EGFP,转染昆虫Sf 9细胞。结果SDS-PAGE和western blot鉴定表明成功表达了分子量约40 000的融合蛋白。以ELISA法检测发现该融合蛋白能与28份抗HCV抗体阳性血清中的15份发生反应,阳性率为53.6%。结论该融合蛋白在昆虫Sf 9细胞中成功表达并具有一定的抗原性。

H5N1高致病性禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达及免疫原性

用昆虫杆状病毒表达系统表达了高致病性禽流感H5N1 HA蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,HA蛋白表达分子量约为70 ku;将HA蛋白制成油乳液,免疫BALB/c小鼠,免疫3次后,收集血清,以血凝抑制试验(HI)和血清IgG抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)评估体液免疫,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)评估细胞免疫。试验结果表明:重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组免疫小鼠后,血清中和抗体效价及ELISA IgG效价均显著高于PBS组,重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著。ELISPOT试验数据显示,重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组小鼠脾单个核细胞分泌IFN-γ和IL-4细胞数量显著高于PBS组,而重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著。用昆虫杆状病毒表达系统表达H5N1 HA蛋白制成油乳液能诱导体液免疫和细胞免疫,能为预防高致病性禽流感H5N1候选疫苗的筛选提供依据。

人纤维介素蛋白2在昆虫杆状病毒系统中的表达及活性检测

目的:利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf9细胞)中表达人纤维介素蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶并检测其蛋白活性。方法:首先将PCR扩增的目的基因hfgl2和pENTR/D-TOPO载体连接,再将pENTR/D-TOPO-hfgl2质粒与BaculoDirectTM线性DNA进行体外基因重组,采用脂质体转染法将重组DNA转染到生长良好的Sf9细胞中进行病毒包装,经过对重组杆状病毒三轮扩增后,用RT-PCR和Western blotting从基因和蛋白水平检测hfgl2表达情况,一期凝固试验检测其蛋白活性。结果:重组杆状病毒感染后,Sf9细胞停止生长,体积变大,细胞开始悬浮,破裂,呈现颗粒样外观。RT-PCR扩增和Western blotting从基因和蛋白水平证实Sf9细胞能够表达hfgl2,蛋白分子量约为63kDa。同时,在细胞上清液中检测到了可溶性hfgl2的表达,蛋白分子量约为50kDa。一期凝固试验证明表达的跨膜型hfgl2具有凝血活性。结论:hfgl2在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达并具有生物学活性,为进一步研究hfgl2跨膜型以及可溶性蛋白功能提供了工具,亦可应用于开发重型肝炎蛋白芯片或ELISA诊断试剂盒。

p15在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

为探讨鸡p15蛋白的特性及其在细胞周期抑制通路中与其他蛋白的作用,本研究选用昆虫细胞表达系统来表达有活性的p15蛋白。为后期纯化的需要,对pFAST供体质粒的多克隆位点进行了重新改造,并成功构建带有TAP纯化标签的供体质粒pFAST-NMCS-N-TAP-p15和pFAST-NMCS-C-TAP-p15。将2个供体质粒转化到DH10Bac感受态菌中,对阳性转化子Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15进行反复涂板的去阴性单克隆纯化,提取大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15并进行转座鉴定。将纯化的大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15转染入sf9昆虫细胞中,72h后收集培养上清中的杆状病毒,并进行病毒的扩增和滴度测定,结果所获2株重组杆状病毒N-TAP-p15和C-TAP-p15的滴度分别为3.6×107,5.4×107pfu/mL。将2株高滴度的重组杆状病毒再感染新培养的sf9昆虫细胞进行重组p15蛋白的表达,结果与对照组相比,重组p15融合蛋白得到了有效的表达,表达量分别为4.32%和4.7%。Western blotting结果表明,所表达的重组p15融合蛋白只特异地与p15单克隆抗体和兔的IgG反应而未与其他细胞蛋白反应;说明带有TAP标签的重组p15融合蛋白在昆虫细胞表达系统中得到了有效表达。

谷氨酸脱羧酶65重组杆状病毒表达载体的构建及其在昆虫细胞中的表达

目的构建谷氨酸脱羧酶GAD65基因的杆状病毒重组供体质粒,包装重组GAD65的杆状病毒,感染昆虫细胞进行表达。方法先将已克隆的GAD65 cDNA与线性化的pFASTBACHTb进行连接,使pFASTBACHTb-GAD65与DH10BAC感受菌进行转座重组,利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid/GAD65克隆,提取Bacmid/GAD65转染昆虫细胞Sf 9包装杆状病毒,利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过免疫荧光、SDS PAGE和Western blot检测表达情况。结果获得了重组GAD65的杆状病毒,细胞能表达出与GAD65单抗结合的蛋白,相对分子质量为65kDa左右,细胞可直接分泌GAD65蛋白至上清。结论GAD65能在昆虫细胞中获得良好表达为研究GAD65的作用及免疫治疗奠定基础,。

白蚁木质纤维酶昆虫细胞表达体系的构建

本研究以通过基因工程方法建立一种能够在昆虫细胞中表达白蚁内源木质纤维酶的昆虫杆状病毒表达体系为目的。通过克隆白蚁内源纤维素酶EG基因片段,将其连入T载体多克隆位点,筛选后获得重组质粒p18EG1,将EG基因片段与pFastBack1质粒连接,转化筛选后获得pFBEG1重组质粒,转染昆虫细胞后,构建获得带有白蚁内源木质纤维酶基因的重组杆状病毒表达体系的方法。研究结果证明了重组杆状病毒可以有效地携带白蚁内源木质纤维酶基因。利用该表达体系作为白蚁内源木质纤维酶表达途径,进一步加以研究,有望提高木质纤维的降解效率,为高效利用木质纤维转化生产生物质能源开创新的途径。

昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达尿激酶原

在转瓶和２Ｌ搅拌反应器中，利用重组杆状病毒ＡｃＮＰＶ感染ｓｆ９昆虫细胞表达尿激酶原。在转瓶中，细胞接毒密度１２×１０６／ｍＬ、ＭＯＩ＝３０时，尿激酶原活性达到１０６５ＩＵ／ｍＬ。研究了尿激酶原表达过程中葡萄糖、乳酸的代谢变化。实验结果表明细胞状态对尿激酶原的表达水平有显著影响。

利用昆虫病毒系统生产表达胰岛素的腺相关病毒

腺相关病毒(Adeno-associated virus-2,AAV-2)用于构建基因治疗病毒载体,在基因治疗领域受到了普遍重视和关注,而rAAV在应用过程中一个很重要的限制因素就是缺乏简单有效的大规模制备方法.运用昆虫细胞表达系统来提高AAV-2的产量,分别采用绿色荧光蛋白(GFP)和胰岛素(Insulin)基因替代AAV-2的结构基因后,与其他重组病毒共转染293t细胞,3 d后即可检测到高效表达的GFP和Insulin.结果表明,该方法能够比较理想地提高AAV的产量,为临床使用奠定了基础.

Sf9昆虫细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立Sf9昆虫细胞宿主蛋白（host cell protein,HCP）含量双抗体夹心ELISA检测方法。方法从Sf9昆虫细胞中提取总蛋白,免疫家兔,制备兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体,经辛酸-硫酸铵沉淀和CL-4B层析柱纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性;用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,采用改良过碘酸钠法将HRP酶标记至纯化的抗体上作为酶标抗体,采用方阵滴定法确定双抗体夹心ELISA方法的最适工作条件。确定该方法的最佳线性范围及最低检测限,验证该方法的准确度及精密度。将表达戊型肝炎ORF2基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞,收获病毒培养上清,制备3批纯化的重组蛋白,用建立的方法检测纯化过程中HCP含量的变化,验证其在纯化工艺中的适用性。与商品化试剂盒进行比较,检测两种方法的灵敏度及在制品中的适用性。结果纯化后的兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶10 000,可与Sf9细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心法ELSA方法最佳抗体包被浓度为20μg/ml,37℃孵育1 h;酶标抗体的工作浓度为1∶200,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min;测定各孔A450值。该方法的最佳线性范围为50～1 600 ng/ml,最低检测为50 ng/ml;不同浓度的Sf9细胞蛋白抗原回收率在87.8%～117%之间,变异系数均小于10%;制备的3批重组蛋白经超滤及层析纯化后,HCP含量均逐渐降低至小于50 ng/ml,纯化工艺可有效去除HCP;与商品化试剂盒比较,该方法更适用于检测戊肝类病毒颗粒样品。结论已成功建立Sf9昆虫细胞残余蛋白含量检测的双抗体夹心法ELSA方法,可用于检测Sf9昆虫细胞/杆状病毒表达系统纯化的重组蛋白中HCP含量。

广西优势血清西优势血清型IBV代表株M基因在杆状病毒系统中的表达

采用RT-PCR扩增鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西优势血清型代表性毒株GX-YL5的膜(M)蛋白基因,将其克隆至pFastBac^(TM)/HBM-TOPO杆状病毒转移载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒rHBM-M;将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒;利用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western-blot)鉴定表达的M蛋白。IFA检测可见重组杆状病毒感染后72h细胞出现特异性荧光,Westernblot检测可见大小约为26ku的特异性蛋白带,表明该重组M蛋白在Sf9昆虫细胞中成功获得表达。研究为IBVM蛋白的生物学功能、IBV诊断试剂和新型疫苗制备等奠定基础。