低温对原代星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白和微丝的影响

用荧光染色方法，观察了低温（２～２２℃）对原代培养的星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）和微丝（ＭＦ）的影响。发现在低于２２℃中处理后，ＧＦＡＰ束和ＭＦ束变细，ＭＦ数量减少。处理时间越长，变化越明显。形态分化良好的细胞的ＧＦＡＰ束耐低温能力提高。结果表明，低温时ＧＦＡＰ束间联结断裂，而其本身无解聚；ＭＦ束间联结断裂，ＭＦ本身出现解聚。

STK25在星形胶质细胞活化和EAE小鼠病变进程中的作用

目的:探讨丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶25(serine/threonine protein kinase 25,STK25)对星形胶质细胞活化及实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠疾病进程的影响。方法:髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55,MOG35-55)诱导小鼠EAE模型,Real-time PCR、Western blot和ELISA法分别检测脊髓组织中STK25、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)与干扰素诱导蛋白-10(interferon-inducible protein-10,IP-10)的转录水平与蛋白表达;免疫荧光双标法检测STK25在脊髓星形胶质细胞中的表达。干扰素(interferon,IFN)-γ体外刺激小鼠原代星形胶质细胞后不同时间,上述方法检测STK25的蛋白表达及细胞因子的转录水平变化。将特异性靶向星形胶质细胞的对照及STK25敲减的重组慢病毒悬液感染星形胶质细胞后,IFN-γ刺激,测定TNF-α与IP-10的转录水平;同时给予小鼠病毒悬液7 d后,诱导EAE模型,Western blot检测脊髓组织STK25的表达;Real-time PCR检测脊髓炎性因子与趋化因子转录水平。HE和劳克坚牢蓝染色(Luxol fast blue,LFB)观察脊髓炎症细胞浸润与髓鞘损伤。结果:与对照组相比,EAE组小鼠STK25的表达水平显著降低,炎性因子与趋化因子的转录与分泌水平明显升高;同时脊髓组织星形胶质细胞STK25的表达明显下降。IFN-γ体外刺激星形胶质细胞STK25表达降低时,炎性因子生成增加;进一步敲减星形胶质细胞内源性的STK25基因,体外星形胶质细胞及体内EAE小鼠脊髓中炎性因子与趋化因子的生成显著升高,同时加剧了EAE小鼠脊髓炎症细胞浸润与髓鞘脱失。结论:STK25可能通过影响星形胶质细胞的活化,调节炎性与趋化因子的产生,从而参与EAE小鼠的病变进程。

胶质纤维酸性蛋白与中枢神经系统疾病

胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)是分子量为50-52kD的酸性蛋白,是星形胶质细胞的主要成分之一,富含谷氨酸和天冬氨酸,以中间微丝蛋白和可溶性蛋白两种形式存在于胶质细胞的胞浆中,是星形胶质细胞的骨架蛋白.GFAP在星形胶质细胞受到刺激引起反应时,其表达发生变化,因此GFAP能够用来特异性地标记星形胶质细胞、并被认为是星形胶质细胞活化的标志[1～3].

缺血预处理星形胶质细胞GDNF抑制p38MAPK信号通路减轻神经元凋亡

目的研究缺血预处理星形胶质细胞分泌GDNF抑制p38MAPK信号通路发挥脑保护作用。方法原代培养神经元及星形胶质细胞,给予缺血预处理,将星形胶质细胞培养基制备成条件培养基,沉默GDNF基因的培养基作为另一种条件培养基,将神经元分为对照组、预处理组、预处理+缺血组、缺血组,应用不同条件培养基孵育神经元,流式细胞术检测神经元凋亡,Western Blot法检测神经元p38MAPK及p-p38MAPK的表达。结果预处理+缺血组和缺血组神经元凋亡率明显增高(P<0.05),加入ACM2后凋亡率较ACM1和ACM3两组均减低(P<0.05)。每组神经元的p38MAPK蛋白表达均无明显变化(P>0.05);预处理+缺血组及缺血组p-p38MAPK的蛋白表达均明显高于对照组和预处理组(P<0.05),预处理+缺血组p-p38MAPK的蛋白表达均较缺血组低(P<0.05),加入ACM2组的p-p38MAPK蛋白表达低于ACM1和ACM3两组(P<0.05)。结论缺血预处理后星形胶质细胞分泌GDNF抑制p38MAPK信号通路的激活从而减少神经元凋亡,起到脑保护作用。

离体脊髓星形胶质细胞的纯化与鉴定

目的探索新生大鼠脊髓星形胶质细胞的分离、培养与传代及纯化方法,鉴定其培养纯度。方法分离、培养新生大鼠脊髓星形胶质细胞,用换液时暴露结合旋转法加以纯化,酶消化法传代后进行免疫组化鉴定,并染核计数星形胶质细胞的纯度。结果星形胶质细胞贴壁快,多在12 h内,3 d后数量显著增加;免疫细胞化学染色显示,NF200抗体染色为阴性,提示培养盖片中不含神经元;GFAP阳性染色细胞高达95.8%。结论换液时短暂暴露结合恒温旋转法可纯化得到高纯度的星形胶质细胞,是一种简单、高效的星形胶质细胞纯化方法。

外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡诱导大鼠星形胶质细胞向神经元的转分化

背景:脊髓损伤会使星形胶质细胞增生进而形成胶质瘢痕阻碍神经轴突的形成,而局部炎症微环境进一步加重了神经元的死亡,因此,将星形胶质细胞转分化为神经元既能减轻星形胶质细胞的增生又能增加神经元的数量,可谓是一举两得。而有关外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡能否诱导星形胶质细胞转分化为神经元尚未见相关报道。目的:探索外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡能否诱导星形胶质细胞转分化为神经元。方法:①采用组织块直接培养法培养SD大鼠鼻黏膜来源外胚层间充质干细胞,并且根据其形态以及免疫荧光进行鉴定,收集细胞上清液以提取细胞外囊泡,通过粒径分析、透射电镜及蛋白免疫印迹予以鉴定;②采用胰酶消化法培养SD大鼠大脑星形胶质细胞,并予以鉴定;③星形胶质细胞分2组干预:分别加入外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡(质量浓度为1 g/L,2 mL培养基内加入细胞外囊泡体积为66μL)和同体积的PBS干预星形胶质细胞72 h;④通过免疫荧光、实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹来检测神经元标志物神经元特异性烯醇化酶及神经丝蛋白200的表达量。结果与结论:①外胚层间充质干细胞形态呈典型梭形并且高表达间充质干细胞标志蛋白CD44、Nestin和Vimentin;外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡呈经典茶托样形态,粒径分布在30-200 nm之间,蛋白免疫印迹显示细胞外囊泡标志蛋白CD9,CD63及TSG101呈现阳性表达;②星形胶质细胞形态呈不规则星状且高表达胶质纤维酸性蛋白;③与对照组相比,外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡组可见较多神经元样细胞,胞体呈梭形且饱满,突起增多变长,并且高表达神经元特异性烯醇化酶及神经丝蛋白200(P<0.05);④以上结果提示,外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡可诱导星形胶质细胞转分化为神经元。

巢蛋白的表达模式及其功能

巢蛋白 (Nestin)属于第Ⅵ类中间丝蛋白 ,主要由胚胎期和成年的神经前体细胞一过性表达 ,在中枢神经系统各种损伤条件下 ,脑中反应性星形胶质细胞和神经元又再现其表达。然而 ,本实验室首次观察到 ,在正常成年大鼠和成人基底前脑存在一个有别于胆碱能神经元的Nestin免疫反应阳性神经元簇 ,并证明了这些Nestin -IR神经元的Nestin表达受卵巢雌激素的影响。Nestin的功能与维持神经前体细胞的正常形态结构有关 ,也可能与其它的中间丝蛋白如神经丝共聚形成多聚体 ,此外 ,尚可能在影响其它蛋白的功能方面发挥作用。

大鼠脊髓胶质瘢痕形成的规律

背景:脊髓损伤后治疗不理想的原因是脊髓组织的囊变和胶质瘢痕的形成,因此,明确胶质瘢痕的发生发展规律具有重要意义。目的:观察大鼠脊髓损伤后脊髓胶质瘢痕形成的空间分布、时间规律,以及轴突变化特征。方法:采用改良Allen重物坠落法建立SD大鼠脊髓损伤模型,分别于损伤后1d,3d,5d,1周,2周,4周,6周,8周,10周,12周取材。以正常饲养的大鼠作对照。结果与结论:大鼠脊髓损伤后4周开始出现致密瘢痕增生,之后瘢痕厚度平稳下降,至损伤后10周形成光滑的囊腔壁,囊腔内无胶质纤维酸性蛋白阳性星形胶质细胞,损伤区囊腔周围的胶质瘢痕内可见密集肥大的星形胶质细胞,未见神经丝蛋白阳性轴突位于囊腔内。提示脊髓损伤后4周胶质瘢痕厚度达到高峰,囊腔与残存轴突之间开始形成机械屏障,损伤后10周瘢痕厚度趋于稳定。

丝切蛋白-1及磷酸甘油酸激酶1在不同放疗敏感性星形胶质细胞瘤中的表达

目的分析不同放疗敏感性星形胶质细胞瘤蛋白表达特点，筛选与放射耐受关系密切的蛋白质。方法通过随访胶质瘤切除术后接受三维适型调强放射治疗的患者，按其存活状况及生活质量分为放疗敏感组（7例）和耐受组（8例），病理诊断均为星形胶质细胞瘤（WHOⅡ级）。采用二维液相色谱串联质谱法（2D—LC—MS／MS）对人组肿瘤标本进行蛋白组学分析，筛选差异表达蛋白。并对放疗耐受相关蛋白丝切蛋白-1（cofilin-1）及磷酸甘油酸激酶1（phosphoglyceratekinaseI，PGKl）用免疫印记法（Westernblot）检测其表达量。结果2D—LC—MS／MS共鉴定出两组问差异表达蛋白36个，以cofilin一1与PGKl含量最为丰富，在放疗耐受组肿瘤中呈高表达状态。Westernblot检测结果与蛋白组学分析相吻合。结论放疗后预后不同的同级别星形胶质细胞瘤问蛋白表达差异明显，以cofilin—I及PGKl为代表，可能成为星形胶质细胞瘤放疗耐受的潜在生物标志物。

星形细胞瘤的免疫组化研究 I GFAP.Vimentin与组织学分级的关系

应用GFAP及Vimentin(ABC法)对74例星形细胞瘤进行了免疫组织化学研究。发现所有肿瘤均有GFAP及Vimentin两种中间丝蛋白。GFAP阳性细胞数与组织学分级呈负相关,而Vimentin与组织学分级无明显关系。V/G值R可以说明星形细胞瘤的分化程度。GFAP及Vimentin有两种显色类型,即核周型与胞浆突起型,显色类型与组织学类型有关,而与组织学分级无关。GFAP的阳性细胞数与细胞密度呈负相关。Rosenthal纤维中心轴GFAP阴性,边缘部分则强阳性。

胶质纤维酸性蛋白星形细胞病的诊治进展

胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)是星形胶质细胞中的一种中间丝蛋白,大小介于微丝和微管之间,参与星形胶质细胞的多种生物学功能。胶质纤维酸性蛋白星形细胞病(Glial fibrillary acidic protein-Astrocytopathy, GFAP-A)是近年来才被认识的一种自身免疫性疾病,2016年美国梅奥诊所的Fang等^([1])首次对该病进行报道.

细胞骨架相关力学敏感基因对胶质母细胞瘤转移的作用机制研究

目的癌症的转移是癌细胞从一个部位到另一个部位的移动是一个复杂的动态过程,需要对细胞骨架进行重塑。先前研究发现,肌动蛋白、微观和中间丝通过复杂的网络来协调肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移。通过研究力学敏感基因对细胞骨架的影响获得人类胶质母细胞瘤迁移的作用机制。

督脉电针对脊髓损伤大鼠脊髓神经连接蛋白1和神经丝蛋白200的影响

目的:通过观察督脉电针对脊髓损伤(SCI)大鼠脊髓中A2型星形胶质细胞(A2s)、A1型星形胶质细胞(A1s)和轴突再生标记物神经丝蛋白200(NF-200)、突触再生标记物神经连接蛋白1(NL1)表达及尼氏体生成情况的影响,探讨督脉电针治疗SCI的可能机制。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中和抗体组、电针组、电针+中和抗体组,每组15只。采用无限视野撞击法建立SCI大鼠模型。中和抗体组与电针+中和抗体组在大鼠造模损伤后即刻注射白细胞介素(IL)-1α、肿瘤坏死因子(TNF)-α、C1q 3种中和抗体。电针组与电针+中和抗体组电针“大椎”“命门”,每次20 min,每日1次,连续治疗28 d。分别于第1、7、14、21、28天进行BBB评分;免疫荧光染色法检测各组大鼠脊髓组织A2s特异性标记物S100a10与GFAP共表达情况,A1s特异性标记物C3表达情况;Western blot法和免疫组织化学法检测大鼠脊髓组织NF-200及NL1表达情况;尼氏染色法观察大鼠脊髓神经元再生情况。结果:与假手术组比较,各时点模型组大鼠BBB评分下降(P<0.01);与模型组比较,造模第7、14、21、28天,中和抗体组、电针组、电针+中和抗体组BBB评分显著升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,中和抗体组、电针组、电针+中和抗体组脊髓组织中GFAP与A2s标记物S100a10双标荧光表达强度升高(P<0.05,P<0.01);电针组A1s标记物C3荧光强度显著降低(P<0.01)。与假手术组比较,模型组脊髓组织NF-200蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,电针组与电针+中和抗体组脊髓组织中NL1蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),电针+中和抗体组中NF-200蛋白表达升高(P<0.01)。与假手术组比较,模型组脊髓组织NL1、NF-200阳性表达降低(P<0.01);与模型组比较,中和抗体组、电针组、电针+中和抗体组NL1、NF-200阳性表达升高(P<0.01);与中和抗体组比较,电针组和电针+中和抗体组中NF-200阳性表达升高(P<0.01)。与假手术组比较,模型组脊髓组织尼氏体数目减少;与模型组比较,中和抗体组、电针组、电针+中和抗体组尼氏体数目增加。结论:督脉电针能够促进A2s激活,这可能是其促进SCI后大鼠轴突、突触的再生的原因之一。

仿真针刺预处理对内脏牵拉痛大鼠行为学的影响及机制研究

目的探讨仿真手针预处理对内脏牵拉痛大鼠的行为学的影响及其抗大鼠内脏牵拉痛的作用机制。方法40只雄性SD大鼠随机分4组(假手术组、VTP组、仿真手针组、电针组),每组10只;后2组分别进行针刺、电针30min后即刻制备VTP模型,观察各组大鼠的疼痛积分,并分别采用免疫组化、生化比色法、放射免疫等方法检测大鼠回肠部肠神经系统的SP阳性表达物、AChE的活性和LEK的含量以及延髓内脏带c-Fos蛋白和GFAP阳性指数的含量。结果与假手术组比较,VTP组大鼠疼痛积分显著升高(P<0.05),回肠部SP阳性表达物、AChE的活性,延髓内脏带c-Fos蛋白、GFAP阳性指数的含量显著增高(均P<0.01),但LEK含量增加不显著(P>0.05);与VTP组比较,仿真手针和电针组大鼠疼痛积分,回肠部SP阳性表达物、AChE的活性,延髓内脏带c-Fos蛋白、GFAP阳性指数的含量显著下降(均P<0.05),电针组LEK含量增加不显著(P>0.05),仿真手针组LEK含量明显增加(P<0.05);与电针组比较,仿真手针组除疼痛积分显著降低(P<0.05)和LEK含量显著增高(P<0.05)外,其他指标无显著性差异(均P>0.05)。结论仿真手针预处理能通过减少SP的释放,减低AChE的活性,增加LEK的释放,下调c-Fos蛋白、GFAP的表达,有效抑制内脏牵拉痛,而仿真手针预处理抑制内脏牵拉痛的效果优于电针,其原因在于仿真手针更能有效增加LEK的释放。

小干扰RNA抑制Vimentin表达对反应性星形胶质细胞的影响及其在胶质瘢痕形成中的意义

目的 观察小干扰RNA （siRNA）干扰波形蛋白（Vimentin）表达对反应性星形胶质细胞的影响并探讨其在中枢神经系统损伤后胶质瘢痕形成中的意义.方法 利用siRNA干扰技术沉默Vimentin表达,转染“#”字法激活的星型胶质细胞,并利用Western blot分析寻找最有效的Vimentin沉默靶点,并采用噻唑蓝（MTT）法分别于24、48、72、96 h检测反应性星形胶质细胞.结果 转染效率最高的siRNA-Vim为24 h,细胞转染效率＞80％;3条siRNA中siRNA-Vim-3对Vimentin的表达有明显的沉默效应.星形胶质细胞转染48 h后,siRNA-Vim组细胞数明显少于对照组（P＜0.05）.siRNA-Vim作用于反应性星形胶质细胞48 h后,反应性星形胶质细胞增殖受到明显抑制,与其他各组比较差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 Vimentin对体外实验中的反应性星形胶质细胞增殖有显著的抑制作用,说明其在中枢神经系统损伤后的胶质瘢痕形成过程中起重要作用.

巢蛋白和神经胶质纤维酸性蛋白在大鼠视网膜发育中的动态表达

目的 观察巢蛋白（nestin）和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在大鼠视网膜发育中的动态变化.方法 48只Wistar大鼠,其中24只大鼠分为出生后1 d,1、2、3、4、7、12、20周8组,每组3只.制作眼球矢状位冰冻切片,采用共聚焦激光显微镜观察nestin和谷氨酰胺合成酶（GS）以及GFAP和GS免疫荧光染色情况.18只大鼠分为出生后id,1、2、3、4、12周,每组3只.提取大鼠视网膜总RNA,实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测nestin、GFAP和GS mRNA表达.选择6只出生后7～12 d新生鼠,取眼球体外培养Müller细胞,行GS和（或）nestin免疫荧光染色,共聚焦激光显微镜观察荧光染色情况.结果 出生后1 d,nestin免疫阳性细胞贯穿神经视网膜全层,主要定位于视网膜前体细胞放射状排列的细长纤维中,在视网膜内侧出现GFAP阳性的星形胶质细胞.出生后1周出现表达GS的Müller细胞,同时表达nestin,但不表达GFAP;GFAP阳性细胞仍然位于视网膜内侧.出生后2～12周,nestin在Mfiller细胞上的表达逐渐减少直至消失,GFAP在星形胶质细胞中的表达强度投有显著变化.体外培养的Müller细胞表达nestin,不表达GFAP.Nestin和GFAP mRNA在视网膜中的表达与免疫荧光染色结果相一致.结论 随大鼠视网膜不断发育,Müller细胞上nestin表达逐渐减少,成年大鼠视网膜Müller细胞不再表达nestin;新生鼠和成年鼠Müller细胞均不表达GFAP.

猫小脑皮质结构的年龄相关性变化

目的:对青年和老年猫小脑皮质结构的年龄性变化进行比较。方法:动用Nissl染色显示小脑皮质神经元,免疫组织化学方法显示胶质纤维酸性蛋白免疫阳性(GFAP-IR)星形胶质细胞和神经丝蛋白免疫阳性(NF—IR)结构。显微镜下观察测量小脑皮质厚度和细胞密度。结果:与青年猫比较,老年猫小脑皮质总厚度及分子层厚度显著下降,颗粒层厚度明显增加,各层神经元密度明显降低;颗粒层中GFAP-IR细胞密度显著增加,阳性反应增强;老年猫蒲肯野细胞(PC)NF免疫阳性树突分支明显减少。结论:衰老过程中小脑皮质神经元丢失和PC中NF阳性树突减少,可能会导致老年小脑皮质接受和整合信息的功能降低,而星形胶质细胞活动增强对皮质神经元可能起保护作用。

脊髓损伤模型大鼠软脊膜下注射2型腺相关病毒免疫荧光染色分析

背景:经软脊膜下注射腺相关病毒的方法可将病毒局限于以注射点为中心的较小范围内,全身毒副作用小,节省病毒的用量,但目前尚无将此方法应用于脊髓损伤大鼠的相关报道,对损伤部位星形胶质细胞和神经细胞的转染情况尚不明确。目的:探讨通过软脊膜下注射2型腺相关病毒对脊髓损伤部位的星形胶质细胞和神经细胞的转染效果及手术过程的技术要点。方法:实验方案经吉林大学动物实验伦理委员会批准。24只Wistar大鼠随机分为2组:腺相关病毒组和模型组,均使用钳夹法构建脊髓损伤模型。腺相关病毒组经软脊膜下注射60μL病毒溶液;模型组经软脊膜下注射等量5%右旋糖酐溶液。于术后7,14和21d取脊髓标本,进行免疫荧光染色,观察星形胶质细胞分布情况和2型腺相关病毒转染情况。结果与结论:①经软脊膜下注射病毒后,病毒溶液最终均匀分布于损伤部位上下约1 cm的范围内;②术后7,14 d仅有微量绿色荧光蛋白在脊髓损伤区域表达,直至术后21 d,在脊髓损伤空洞周围可见有大量反应性星形胶质细胞,其在脊髓空洞周边部表达最为强烈,出现明显的胶质界膜;同时发现,2型腺相关病毒可稳定转染星形胶质细胞和神经细胞,其中星形胶质细胞集中分布于脊髓空洞周边部,而神经细胞散在分布于病毒转染范围内,注射范围以外正常组织仅见微量2型腺相关病毒转染;③该方法具有能将病毒局限于损伤部位,可靶向性转染星形胶质细胞和神经细胞,具有注射量病毒量低,全身毒副作用小,成本节约等优点。