益脾养肝方对肝癌前病变大鼠肝星状细胞活化的影响

目的探讨益脾养肝方对二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)诱导的肝癌前病变中肝星状细胞活化及胶原沉积的影响。方法将26只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为空白组、模型组、益脾养肝方组和护肝片组,空白组5只,其余3组各7只。腹腔注射DEN诱导肝癌前病变模型,给药14 w后处死。取肝组织观察并记录其大小、外观等变化,计算肝重比(肝脏指数),通过HE染色观察大鼠肝组织病理形态学改变,天狼星红染色观察各组胶原沉积表达,免疫组化检测α-平滑肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)的表达,实时定量PCR(Real Time PCR,RT-PCR)检测Ⅰ型胶原蛋白(typeⅠcollagen,CollagenⅠ)的表达,以研究益脾养肝方对大鼠肝癌前病变模型的影响。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果与模型组相比,益脾养肝方组和护肝片组肝脏病理形态显著改善,肝脏指数、CollagenⅠ和α-SMA表达均降低(P值均<0.05);与护肝片组相比,益脾养肝方组对肝脏的保护作用更显著,其肝脏指数、CollagenⅠ和α-SMA表达均显著降低(P值均<0.05)。结论益脾养肝方可有效改善DEN诱导的大鼠肝癌前病变,其机制可能与抑制肝星状细胞活化,减少胶原沉积有关。

肝星状细胞特异性Grk2基因敲除小鼠模型的制备及鉴定

目的利用Cre-loxP基因敲除技术建立肝星状细胞特异性G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)基因敲除小鼠模型,为研究GRK2在肝星状细胞中的生物学功能提供动物模型基础。方法将loxP标记的Grk2基因小鼠(Grk2^(fl/fl))和Lrat-Cre工具鼠进行多次繁殖,建立肝星状细胞特异性Grk2基因敲除(Grk2^(ΔHSC))小鼠模型。观察和分析小鼠的生长繁殖情况;通过PCR反应鉴定flox和Cre基因型;免疫荧光双染检测肝星状细胞中GRK2表达;Western blot检测小鼠肝星状细胞及肺、脾、肾脏、心脏组织中GRK2蛋白表达;HE染色观察肝脏及肺、脾、心脏、肾脏组织学形态。结果成功鉴定Grk2^(ΔHSC)小鼠基因型;两组小鼠体质量、繁殖能力无明显差异;免疫荧光双染及Western blot结果表明,Grk2^(ΔHSC)小鼠的肝星状细胞中GRK2蛋白水平明显低于对照组小鼠,Grk2^(ΔHSC)小鼠肺、脾、肾脏和心脏组织中GRK2蛋白表达与对照组相比无明显变化;HE染色结果显示,Grk2^(ΔHSC)小鼠肝脏及主要组织结构与Grk2^(fl/fl)相比差异无显著性,可用于后续研究。结论本研究应用Cre-loxP技术成功构建了肝星状细胞特异性Grk2基因敲除小鼠,为进一步研究GRK2在肝脏中的作用提供了优良工具。

平足蛋白(PDPN)在肝星状细胞活化以及肝纤维化中的作用分析

目的探究平足蛋白(PDPN)在肝星状细胞活化以及肝纤维化中的作用,并对其机制进行初步探讨。方法收集2019年9月—2022年6月首次就诊于上海中医药大学附属普陀医院感染科的75例慢性乙型肝炎患者肝活检组织样本,实时定量PCR(RT-PCR)和免疫组化检测PDPN在不同肝纤维化分期患者肝组织中的表达。12只雄性C57/BL6小鼠随机分为正常组和模型组,每组各6只。模型组腹腔注射含10%CCl_4,对照组注射等体积橄榄油共6周,HE染色、天狼星红染色观察肝组织病理学变化,分离小鼠肝脏原代细胞,检测PDPN mRNA在各类型细胞中表达;使用PDPN蛋白处理小鼠原代肝星状细胞,并使用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理,分析PDPN诱导肝星状细胞炎症因子表达情况。计量资料2组间比较采用成组t检验,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。两组数据相关性分析采用Spearman相关性分析法。结果慢性乙型肝炎患者肝活检样本中,PDPN mRNA在正常肝脏中表达较低,S3、S4期肝组织中表达显著升高,与正常肝组织比较差异均有统计学意义(P值均<0.001);免疫组化染色结果显示,PDPN阳性表达主要集中在纤维间隔及肝窦,S4期肝组织PDPN阳性面积比S0期表达显著升高(t=8.892,P=0.001)。正常组小鼠中PDPN主要在肝窦表达少许,在CCl_4模型小鼠中PDPN表达显著升高(t=0.95,P<0.001),主要在纤维间隔表达;RT-PCR结果显示,PDPN mRNA在CCl_4模型小鼠中显著升高(t=11.25,P=0.002)。与肝细胞、肝星状细胞、Kupffer细胞和肝内胆管细胞相比,PDPN在肝窦内皮细胞中明显高表达(F=20.56,P<0.001);PDPN蛋白处理小鼠原代肝星状细胞15 min,炎症相关因子TNF-α、CCL3、CXCL1和CXCR1的m RNA表达,与对照组相比均显著升高(P值均<0.05),BAY11-7082(NF-κB信号抑制剂)处理后,上述炎症指标水平均明显下降(P值均<0.05)。结论在肝纤维化中主要表达在肝窦内皮细胞的PDPN增加,其通过NF-κB信号调节肝星状细胞活化,促进肝纤维化进展。

通过单细胞测序分析瘢痕相关巨噬细胞影响肝星状细胞活化的分子机制

目的建立体外诱导人巨噬细胞为瘢痕相关巨噬细胞(scar-associated macrophages,SAMs)的实验方案,研究SAMs使肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化的分子机制。方法利用已发表的人和小鼠纤维化肝组织非实质细胞的单细胞测序数据,分析SAMs中纤维化相关功能基因的表达。使用佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)和纤维蛋白溶酶原(plasminogen,PLG)把人单核细胞系THP-1诱导成为SAMs。收集SAMs培养上清与人HSCs细胞系LX-2共培养。采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)的方法检测SAMs标志物、纤维化相关功能基因和HSCs活化标志物的表达。结果单细胞测序结果显示,不同病因造成的小鼠纤维化肝组织或肥胖患者损伤肝组织中均存在SAMs,且均高表达其标志基因和纤维化相关基因SPP1、CTSD。联合使用PMA及PLG使THP-1的SAMs标志物CD9、TRME2、LGALS3、CD63表达水平升高,同时SPP1、CTSD表达水平升高。体外诱导的SAMs培养上清可以使LX-2活化。结论SAMs存在于各种病因导致的人或小鼠损伤/纤维化肝组织中,并具有相似的特征和功能。联合使用PMA及PLG可将THP-1诱导为SAMs。SAMs可能通过产生SPP1、CTSD促进肝星状细胞活化,从而推进肝纤维化的发生与发展。

以肝星状细胞为靶标的抗肝纤维化治疗进展

肝纤维化是指慢性肝脏疾病发展过程中,肝细胞被反复破坏再生,导致细胞外基质在肝脏中过度沉积的结局。肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell, HSC)是损伤肝脏的纤维化形成过程中主要的细胞类型,且有部分细胞因子参与。目前,临床中防治肝纤维化的重要途径就是抑制HSC的增殖、激活,促进HSC凋亡。本文就以HSC作为靶标的抗肝纤维化治疗方案展开综述。

丹参酮ⅡA通过调控miR-27a抑制肝星状细胞活化的机制研究

目的探讨丹参酮ⅡA(TⅡA)通过调控微小RNA-27a(miR-27a)抑制人肝星状细胞(LX2细胞)活化的机制。方法使用10μg/L转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导LX2细胞活化;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测miR-27a的表达;瞬时转染miR-27a的模拟物和抑制剂增强或抑制miR-27a的表达,细胞计数(CCK-8)法检测细胞增殖情况,Western blot法检测胶原蛋白Iα2(COL1A2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(P-GSK3β)、分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)的表达;用不同浓度的TⅡA干预LX2细胞,CCK-8法检测细胞增殖情况,RT-qPCR检测miR-27a的表达,Western blot法检测COL1A2、α-SMA、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、P-GSK3β、SFRP1和细胞周期蛋白D1(CCND1)的表达。结果miR-27a在TGF-β1干预的LX2细胞中表达增加(P<0.05)。LX2细胞中miR-27a被敲低48 h和72 h后,细胞增殖显著被抑制(P<0.05),抑制miR-27a表达减少了LX2细胞中COL1A2、α-SMA和P-GSK3β蛋白的表达,却增加了SFRP1蛋白的表达(P<0.05),过表达miR-27a则呈现相反的结果(P<0.05)。TⅡA能抑制LX2细胞的增殖,其显著降低了miR-27a的表达,且下调了COL1A2、α-SMA、P-GSK3β、CCND1蛋白的表达并上调了SFRP1蛋白的表达(P<0.05)。结论miR-27a在活化的LX2细胞中表达升高,并能促进LX2细胞的增殖和活化。TⅡA通过下调miR-27a抑制Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路激活,进而抑制LX2细胞活化。

胰腺星状细胞在胰腺导管腺癌肿瘤微环境中的作用研究进展

胰腺导管腺癌(PDAC)是胰腺癌中一种常见的恶性肿瘤类型,疾病进展快、恶性程度高、预后差、对放化疗不敏感。PDAC的恶化、远处转移、治疗抵抗不仅取决于PDAC细胞,肿瘤微环境在疾病进展与演变的过程中也发挥着不可或缺的作用。胰腺星状细胞(PSCs)是建设肿瘤微环境重要的参与者,为癌细胞的“成长”构建一个“舒适”的微环境。本文通过总结PSCs在肿瘤微环境的发挥的作用以及对PDAC的影响,希望可以从肿瘤微环境方面改善治疗方案,提高患者的生存率。

SOX9调控肝星状细胞活化与增殖促进肝纤维化进展

目的探究SOX9基因对肝星状细胞活化与增殖的影响。方法通过每周三次腹腔注射15%的四氯化碳或玉米油构建肝纤维化及对照小鼠模型。HE染色、Masson染色观察小鼠肝纤维化造模情况,qPCR检测小鼠肝脏SOX9、α-SMA、Col1基因表达。用TGFβ1细胞因子诱导LX2细胞活化,qPCR检测LX2细胞活化状态及敲减SOX9基因后SOX9、α-SMA、Col1、CyclinD1、PCNA基因mRNA表达。结果HE、Masson染色表明肝纤维化模型成功构建。qPCR结果表示肝纤维化标志基因α-SMA(造模组:2.568±0.726,对照组:1.000±0.272,t=4.518,P=0.002)与Col1表达明显上升(造模组:3.125±0.775,对照组:1.000±0.398,t=5.454,P=0.001)。SOX9基因在纤维化的小鼠肝脏中也显著上升(造模组:1.986±0.634,对照组:1.000±0.288,t=3.126,P=0.014)。在活化的LX2细胞中SOX9基因表达显著上调(活化组:1.718±0.395,对照组:1.000±0.155,t=3.783,P=0.005),敲减SOX9基因后胶原合成基因α-SMA(敲减组:0.621±0.142,对照组:1.000±0.188,t=3.590,P=0.007)与Col1(敲减组:0.558±0.170,对照组:1.000±0.130,t=4.608,P=0.002)以及增殖相关基因CyclinD1(敲减组:0.614±0.106,对照组:1.000±0.166,t=4.392,P=0.002)和PCNA(敲减组:0.525±0.138,对照组:1.000±0.234,t=3.897,P=0.005)表达明显下降,肝星状细胞活化与增殖被明显抑制。结论SOX9基因在肝纤维化小鼠肝脏中表达明显上升,敲减SOX9基因可以明显减轻肝星状细胞的活化,可能成为治疗肝纤维化的靶点。

荔枝核总黄酮对活化的人肝星状细胞的作用机制

研究荔枝核总黄酮(Total flavonoids of semen litchi, TFL)对活化的人肝星状细胞(human hepatic stellate cell,HSC-LX2)的作用机制。方法 ELISA法检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α) 、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)的表达。流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果 TFL可减少活化的HSC-LX2中TNF-α、IL-6的表达,阻滞细胞于G0/G1期,促进细胞凋亡。结论 TFL可减少活化的HSC-LX2细胞炎症因子的产生,促进其凋亡,从而达到抗肝纤维化的效果。

Journal of Hepatology|辣椒素受体(TRPV1)通过募集SARM1维持肝星状细胞静止状态

肝纤维化病理特征是细胞外基质(ECM)沉积增多形成纤维间隔,是各类慢性肝病进展至肝硬化的中间病理环节,肝星状细胞(HSC)活化是肝纤维化中ECM产生的主要来源,然而HSC活化的机制尚未完全明确。因此,探究HSC从静息到活化状态的调控机制及其干预靶点具有重要意义。辣椒素受体(TRPV1)是一种瞬时受体电位通道,是热和辣椒素的分子传感器,参与疼痛生理和神经源性炎症,并且对非酒精性脂肪性肝炎有保护作用,这表明TRPV1在慢性肝病中具有潜在的研发价值。

沉默CTGF对肝星状细胞凋亡及胞外基质表达的影响

目的 观测沉默结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)基因对肝星状细胞T6(hepatic stellate cell T6,HSC_T6)的生长与凋亡,以及增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、CTGF、整合素α5(integrin alpha 5,Itgα5)和Ⅰ型胶原(collagenⅠ, ColⅠ)表达的影响。方法 将CTGF-shRNA病毒感染HSC_T6(实验组)。空病毒感染的HSC_T6(空病毒组)或未感染的HSC_T6(正常组)作对照。在显微镜下观测被感染HSC_T6的生长与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表达变化;采用CCK-8(cell count kit-8)比色检测被感染HSC_T6的增殖情况;流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测被感染HSC_T6的凋亡情况。定量PCR、Western blot及免疫荧光细胞化学分别检测PCNA、CTGF、Itgα5和ColⅠ的表达变化。结果 在显微镜下观察到被感染的HSC_T6高表达GFP。CCK-8结果表明,与对照相比,沉默CTGF基因的HSC_T6生长显著受抑,72 h开始其差异具统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果显示,沉默CTGF基因可诱导HSC_T6凋亡。定量PCR、Western blot及免疫荧光细胞化学结果证实,沉默CTGF基因可在mRNA及蛋白水平明显下调HSC_T6的PCNA、CTGF、Itgα5与ColⅠ的表达,与对照比较,差异均具统计学意义(P<0.05)。结论 沉默CTGF基因可下调HSC_T6的PCNA、CTGF、Itgα5及ColⅠ的表达,抑制HSC_T6的生长,诱导HSC_T6凋亡,其机制可能和HSC_T6的CTGF/Itgα5信号通路受阻紧密相关。

LncRNA XR_378418对肝星状细胞生物学行为及转录组学影响

目的探究长链非编码RNA(LncRNA)XR_378418在肝星状细胞JS-1生物学行为中的作用,并基于转录组测序探索LncRNA XR_378418参与肝纤维化发生的潜在分子机制。方法构建重组质粒pcDNA-LncRNA XR_378418和pcDNA-NC,分别转染JS-1细胞;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、细胞计数试剂盒8(CCK-8)以及划痕实验分别检测LncRNA XR_378418的表达水平、JS-1细胞增殖和迁移情况;通过高通量测序分析LncRNA XR_378418对JS-1细胞转录组学的影响。结果RT-qPCR结果显示,过表达组中的LncRNA XR_378418表达水平高于对照组(P<0.05);CCK-8和划痕结果显示,LncRNA XR_378418表达增加后,JS-1细胞增殖和迁移能力增强;高通量测序结果显示,共挑选出248个差异基因,其中上调的基因有127个、下调的基因有117个;基因本体论(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能富集分析结果显示,LncRNA XR_378418过表达改变了JS-1细胞部分基因的转录能力,参与调控细胞黏附、细胞自噬、Ca 2+信号传导等功能。结论LncRNA XR_378418可促进JS-1细胞增殖和迁移,影响JS-1细胞中细胞黏附、钙离子信号转导等相关基因的表达。

基于“肝病实脾”理论探讨逍遥散对肝纤维化大鼠肝星状细胞铁死亡的影响

目的:基于“肝病实脾”理论探讨逍遥散对肝纤维化大鼠肝星状细胞铁死亡的影响。方法:采用腹腔注射四氯化碳的方法建立肝纤维化大鼠模型,随机分为模型组、逍遥散组、水飞蓟宾葡甲胺组,每组12只,另选12只SD大鼠腹腔注射等剂量玉米油设为对照组,以逍遥散、水飞蓟宾葡甲胺分组处理后检测各组大鼠肝功能指标天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT);检测各组大鼠肝指数并以Masson染色检测各组大鼠肝纤维化,比较其肝胶原容积分数(CVF);以免疫组织化学染色检测各组大鼠肝星状细胞活化,比较其肝组织α-SMA阳性表达;通过16SrRNA基因测序检测各组大鼠肠道菌群改变。分离培养上述各组大鼠原代肝星状细胞(HSC),以试剂盒测定各组大鼠HSC铁死亡指标:铁含量、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)水平;以免疫印迹法检测各组大鼠HSC铁死亡标志蛋白[长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)、环加氧酶2(PTGS2)、谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)]表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠拟杆菌目丰度、HSC铁含量、MDA水平、ACSL4与PTGS2蛋白表达均明显降低(P<0.05),血清AST与ALT水平、肝指数、肝CVF、肝组织α-SMA阳性比、ACE指数、梭菌目丰度、HSC中GSH水平与GPX4蛋白表达均明显升高(P<0.05);与模型组相比,逍遥散组、水飞蓟宾葡甲胺组大鼠拟杆菌目丰度、HSC铁含量、MDA水平、ACSL4与PTGS2蛋白表达均升高(P<0.05),血清AST与ALT水平、肝指数、肝CVF、肝组织α-SMA阳性比、ACE指数、梭菌目丰度、HSC中GSH水平与GPX4蛋白表达均降低(P<0.05);与逍遥散组相比,水飞蓟宾葡甲胺组大鼠各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:逍遥散可通过诱导肝星状细胞铁死亡而抑制其活性,进而减轻肝纤维化大鼠肝组织肝纤维化,减轻其肝功能损伤,最终对大鼠发挥明显肝保护作用。

SHP2过表达抑制人肝星状细胞LX-2凋亡

目的探讨含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)过表达对人肝星状细胞LX-2凋亡的影响。方法将表达绿色荧光蛋白(GFP)的空病毒Ad-GFP、表达野生型SHP2及GFP的腺病毒Ad-SHP2转染LX-2细胞。实验分为3组:(1)Control组,以DMEM代替腺病毒转染LX-2细胞;(2)Ad-GFP组,转染空病毒Ad-GFP;(3)Ad-SHP2组,转染重组腺病毒Ad-SHP2。Western blotting检测3组LX-2细胞的SHP2、Bax、Bcl-2蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测3组LX-2细胞的SHP2 mRNA表达;TUNEL及膜联蛋白-V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测3组LX-2细胞凋亡情况。结果Ad-SHP2组LX-2细胞的SHP2蛋白及mRNA相对表达量高于Control组及Ad-GFP组(P<0.05);Ad-GFP组与Control组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。TUNEL及膜联蛋白-V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测结果显示,与Control组LX-2细胞凋亡率(3.08±0.73)%、(9.44±0.80)%及Ad-GFP组(3.25±0.85)%、(8.89±1.98)%比较,Ad-SHP2组(1.52±0.26)%、(2.44±0.93)%降低(P<0.05);Ad-GFP组与Control组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组LX-2细胞的Bax及Bcl-2蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05);Ad-SHP2组LX-2细胞的Bax蛋白相对表达量(1.55±0.21)低于Control组(1.99±0.15)及Ad-GFP组(2.00±0.16)(P<0.05);而Bcl-2蛋白相对表达量(2.13±0.25)则高于Control组(1.71±0.15)及Ad-GFP组(1.52±0.14)(P<0.05);但Ad-GFP组与Control组Bax及Bcl-2蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论SHP2过表达通过升高Bcl-2/Bax抑制体外人肝星状细胞LX-2凋亡。

miR-29在乙型肝炎肝硬化患者中的表达及对肝星状细胞活化和上皮间充质转化的影响

目的 探讨miR-29在乙型肝炎肝硬化患者中的表达及对肝星状细胞(HSC)活化和上皮间充质转化(EMT)的影响。方法 选择2020年6月至2022年6月应城市人民医院收治的104例乙型肝炎患者作为研究对象,其中单纯乙型肝炎患者52例(设为慢性乙肝组),乙型肝炎合并肝硬化患者52例(设为乙肝肝硬化组)。采用实时荧光定量PCR法测定血清miR-29a、mi R-29b和miR-29c的表达水平,并分析miR-29与乙型肝炎肝硬化患者Child-Pugh分级和临床分期的关系。用miR-29a/b/c重组慢病毒感染人HSC系LX-2,制备过表达miR-29细胞模型,并分析过表达miR-29对LX-2细胞增殖、活化和EMT的影响。结果 与慢性乙肝组相比,乙肝肝硬化组血清miR-29a、miR-29b和miR-29c的表达水平均显著降低(P均<0.01)。乙型肝炎肝硬化患者血清miR-29a、miR-29b、mi R-29c的表达水平均随着ChildPugh分级增高及临床分期加重而逐渐降低,组间差异均有统计学意义(P均<0.01)。Pearson相关性分析结果显示,乙肝肝硬化组血清miR-29a、miR-29b、miR-29c的表达水平与Child-Pugh分级和临床分期均呈显著负相关(P均<0.01)。与空白对照组相比,重组慢病毒组的细胞增殖率显著降低,且α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(COLⅠ)、Ⅲ型胶原(COLⅢ)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)的蛋白及其m RNA的表达水平均显著降低,E-钙黏蛋白(E-cadherin)的蛋白及其mRNA的表达水平均显著升高,组间差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论 乙型肝炎肝硬化患者血清miR-29的表达水平较低,且其与Child-Pugh分级和临床分期相关;过表达mi R-29可能通过抑制HSC增殖、活化及EMT而发挥抗肝纤维化作用。

诱导肝星状细胞铁死亡治疗肝纤维化的研究进展

铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式,通过使肝星状细胞(HSC)失活、抑制肝纤维化和诱导肝细胞死亡参与肝纤维化发病机制,药物诱导HSC铁死亡治疗肝纤维化。探索诱导HSC铁死亡成为治疗肝纤维化的新靶点。

吡非尼酮对人肝星状细胞LX2增殖、活化以及糖酵解途径的影响

目的 探讨吡非尼酮(PFD)对人肝星状细胞LX2增殖、活化以及糖酵解途径的影响,分析其抗肝纤维化的作用途径。方法 用10μg/L转化生长因子-β1(TGF-β1)激活LX2细胞,将LX2细胞分为正常组[0.1%二甲基亚砜(DMSO)]、对照组(10μg/L TGF-β1+0.1%DMSO)及实验组(10μg/L TGF-β1+2、4、6及8 mmol/L PFD);用CCK-8法和平板克隆实验评价LX2细胞增殖能力,试剂盒检测细胞培养上清中的葡萄糖及乳酸水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(COL1A1)、葡萄糖转运蛋白1(Glut1)、己糖激酶2(HK2)、血小板型磷酸果糖激酶(PFKP)、M2型-丙酮酸激酶(PKM2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)以及单羧酸转运蛋白1(MCT1)蛋白表达,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测α-SMA、COL1A1、Glut1、HK2、PKM2、LDHA mRNA表达。结果 与正常组比较,对照组LX2细胞的增殖能力增强,α-SMA、COL1A1蛋白及mRNA表达增加(P<0.05),葡萄糖消耗及胞外乳酸积累增多,Glut1、HK2、PFKP、PKM2、LDHA、MCT1蛋白及Glut1、HK2、PKM2、LDHA mRNA水平升高;与对照组比较,实验组LX2细胞增殖受到抑制,α-SMA、COL1A1蛋白表达降低,细胞葡萄糖消耗及胞外乳酸积累减少,LX2细胞Glut1、HK2、PFKP、PKM2、LDHA、MCT1的蛋白及Glut1、HK2、PKM2、LDHA mRNA水平下降(P<0.05)。结论 PFD能抑制LX2细胞的增殖及活化,减少细胞外基质分泌,其抗纤维化能力可能与糖酵解水平下调、细胞能量代谢受扰有关。

铁死亡参与无机砷致人肝星状细胞活化的研究

目的研究亚砷酸钠(NaAsO 2)对人肝星状细胞(LX-2)铁死亡的影响。方法体外培养LX-2细胞,采用成组设计将不同浓度NaAsO 2(5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L)染毒LX-2细胞24h,构建体外NaAsO 2致LX-2活化模型,同时设立对照组;透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察NaAsO 2处理LX-2细胞线粒体结构变化情况;荧光显微镜和荧光酶标仪检测细胞Fe 2+水平;比色法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;蛋白免疫印迹法检测溶质载体家族7号成员11(solute carrier family number 7member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平。结果TEM结果显示,NaAsO 2组细胞线粒体膜完整性破损,线粒体嵴减少和消失;此外,与对照组比较,NaAsO 2处理组Fe 2+水平均升高(P<0.05);不同剂量NaAsO 2组MDA含量差异均有统计学意义(F=7.18,P均<0.05)。其中,与对照组比较,5、15μmol/L NaAsO 2组LX-2细胞MDA含量均高于对照组(P<0.05);在翻译水平上,纤维化指标α-SMA蛋白表达水平随着NaAsO 2剂量的升高而表达上调(P<0.05),铁死亡指标SLC7A11和GPX4蛋白表达水平随着NaAsO 2剂量的升高而减少(P<0.05)。结论铁死亡参与NaAsO 2致LX-2细胞活化过程。

RhoA/ROCK信号转导通路介导高糖诱导的大鼠肝星状细胞的增殖和胶原合成

目的探讨RhoA/ROCK信号转导通路在高糖诱导大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖和胶原合成中的作用。方法将SD大鼠肝星状细胞株HSC-T6在1640培养基中培养24 h,实验设置对照组(含5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(含25 mmol/L葡萄糖)、高渗透压组(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)、高糖+法舒地尔(12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L)组。采用MTS法检测细胞增殖率;采用羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)试剂盒测定细胞上清中Hyp水平;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)测定Ⅰ和Ⅲ型前胶原mRNA的相对表达量;采用Western blot检测肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)和p38MAPK的磷酸化和总体水平。结果与对照组相比,高糖组MYPT1(0.270±0.007 vs 0.090±0.008,P<0.001)、ERK(0.851±0.027 vs 0.175±0.038,P<0.001)、JNK(0.869±0.037 vs 0.488±0.022,P<0.001)和p38MAPK(0.498±0.020 vs 0.144±0.011,P<0.001)磷酸化水平显著增高,HSC增殖率(A值)(2.372±0.098 vs 1.588±0.087,P<0.001)和Hyp水平(27.924±1.069 vs 17.643±0.112,P<0.001)显著增高,Ⅰ型前胶原mRNA(2.783±0.167 vs 1.004±0.008,P<0.001)和Ⅲ型前胶原mRNA(4.958±0.143 vs 1.098±0.014,P<0.001)表达显著上调。与高糖组相比,高糖+法舒地尔(25μmol/L、50μmol/L)组MYPT1(0.110±0.007,P<0.001;0.101±0.006,P<0.001)、ERK(0.473±0.025,P<0.001;0.223±0.031,P<0.001)、JNK(0.688±0.024,P=0.019;0.576±0.035,P<0.001)和p38MAPK(0.350±0.021,P=0.012;0.305±0.015,P=0.019)磷酸化水平显著降低,HSC增殖率(A值)(1.819±0.104,P<0.001;1.613±0.103,P<0.001)和Hyp水平(21.430±0.714,P<0.001;18.574±0.825,P<0.001)显著降低,Ⅰ型前胶原mRNA(1.580±0.154,P<0.001;1.167±0.157,P<0.001)和Ⅲ型前胶原mRNA(3.166±0.073,P<0.001;2.524±0.085,P<0.001)表达显著下调。高糖+法舒地尔12.5μmol/L组MYPT1、ERK、JNK和p38MAPK磷酸化水平及Hcy水平均显著高于高糖+法舒地尔25μmol/L组和高糖+法舒地尔50μmol/L组(P均<0.001),高糖+法舒地尔25μmol/L组显著高于高糖+法舒地尔50μmol/L组(P均<0.001)。结论RhoA/ROCK信号转导通路可能通过激活下游的MAPKs介导了高糖诱导的肝HSC的增殖和胶原合成,ROCK可能是防治糖尿病肝纤维化的新靶点。

独立生长因子1负调控GREM1基因抑制肝星状细胞增殖与活化实验研究

目的:探讨独立生长因子1(GFI1)负调控GREM1基因对肝星状细胞(HSC)增殖与活化的影响。方法:选择HSC细胞株LX-2培养并进行相关实验。采用CCK-8法检测GREM1基因和GFI1对LX-2细胞增殖的影响。采用Western blot分析GREM1基因和GFI1对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响。利用生物信息学方法分析GREM1基因的转录因子并通过染色质免疫共沉淀(CHIP)实验验证GREM1基因是否可与GFI1结合。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测GFI1对GREM1 mRNA的影响。通过抑制GFI1并下调GREM1表达分析GFI1是否通过负调控GREM1抑制LX-2细胞增殖和α-SMA表达。结果:过表达GREM1可促进LX-2细胞增殖及上调α-SMA蛋白表达水平(均P<0.05)。GFI1可能是GREM1的上游转录因子,CHIP实验证实GFI1可与GREM1直接结合。下调GFI1表达可促进GREM1 mRNA表达和LX-2细胞增殖,并上调α-SMA蛋白表达水平(均P<0.05)。下调GREM1表达可以减弱GFI1表达(P<0.05)。结论:GREM1可促进HSC活化,而GFI1可通过负调控GREM1基因抑制HSC增殖与活化。