基于TGF-β1/Smad信号通路栀子苷抑制肝星状细胞(HSC)活化的机制研究

目的:探究栀子苷基于TGF-β1/Smad信号通路抑制肝星状细胞(HSC)活化的机制研究。方法:培养人HSC细胞,进行传代培养后在对数生长期细胞进行分组,设置对照组(不加试剂)、TGF-β1组和TGF-β1+栀子苷三组,处理48 h后,利用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测TGF-β1/Smad2/Smad3表达,观察栀子苷通过TGF-β1/Smad信号通路对HSC活化的影响,进一步检测HSC细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin)和胶原蛋白Ⅰ(collagenI)的基因表达水平情况,分析栀子苷对HSC细胞活化增殖的抑制影响;体内实验将小鼠随机分为3组:对照组、CCl4组和CCl4+栀子苷组(每组n=6),采用Western blot分析法观察纤维化间隔HSC激活标记物α-SMA细胞积聚情况,ELISA法检测小鼠血清,观察肝纤维化程度指标HA、PC-III、CIV和LN水平,Western blot法检测小鼠肝脏中TGF-β1和p-Smad2/3的蛋白表达。结果:(1)细胞TGF-β1处理组TGF-β1/Smad2/Smad3表达显著升高,栀子苷可有效降低TGF-β1/Smad2/Smad3表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)细胞TGF-β1处理组collagenI/fibronectin/α-SMA表达显著升高,栀子苷可有效降低组collagenI/fibronectin/α-SMA表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)动物CCL4处理组collagenI/fibronectin/α-SMA表达显著升高,栀子苷可有效降低collagenI/fibronectin/α-SMA表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)动物CCL4处理组HA、PC-III、CIV和LN表达显著升高,栀子苷可有效降低HA、PC-III、CIV和LN表达水平表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)动物CCL4处理组TGF-β1/Smad2/Smad3表达显著升高,栀子苷可有效降低TGF-β1/Smad2/Smad3表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:栀子苷通过TGF-β1/Smad信号通路抑制肝星状细胞(HSC)活化,通过下调collagenI/fibronectin/α-SMA表达减轻HSC细胞的纤维化,具有重要的临床前价值,可为肝脏抗纤维化治疗新药开发提供理论依据。

熊果酸(UA)对大鼠活化型肝星状细胞(HSC)的NADPH氧化酶(NOX)亚基及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路活化的影响

目的观察熊果酸(ursolic acid,UA)对大鼠活化型肝星状细胞-6(hepatic stellate cell T6,HSC-T6)NADPH氧化酶(NAPDH oxidase,NOX)亚基及其调控的磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶(phosphatidyl inosit013-kinase/Akt,PBK/Akt)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)信号通路及其对基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、基质金属蛋白酶-1(metalmatrix proteinase-1,MMP-1)蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期的HSC-T6细胞,随机分成6组:空白对照组、瘦素组(100 ng/mL)、UA干预组(UA 50μmol/L+瘦素)、NOX抑制剂DPI干预组(DPI 20μmol/L+瘦素)、P38MAPK抑制剂SB203580干预组(SB203580 10μmol/L+瘦素)及PI3K抑制剂LY294002干预组(LY294002 10μmol/L+瘦素)。采用Western blot法分别检测NOX亚基gp91^(phox)、p22^(phox)、p67^(phox)、Rac1蛋白表达;信号通路PI3K、Akt、P38MAPK的活化及TIMP-1、MMP-1蛋白表达。结果 UA能显著抑制瘦素诱导的gp91^(phox)、p22^(phox)、p67p^(phox)、Rac1蛋白表达(P均<0.01),但UA对gp91^(phox)、p67^(phox)蛋白表达的抑制作用不及DPI和LY294002。UA能抑制瘦素诱导的PI3K蛋白表达及Akt、P38MAPK蛋白磷酸化(P均<0.01),与DPI及LY294002作用的差异无统计学意义。UA能抑制瘦素诱导的TIMP-1蛋白表达,同时促进MMP-1蛋白表达(P均<0.01)。结论 UA能抑制瘦素诱导的大鼠HSC-T6细胞NOX亚基gp91p^(phox)、p22ph^(phox)、p67p^(phox)、Rac1表达及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路的活化;其下调TIMP-1蛋白及上调MMP-1蛋白表达的机制可能与UA抑制NOX调控的PI3K/Akt及P38MAPK信号通路有关。

小鼠肝星状细胞(HSC)中ATF5促进TRAIL基因的表达及其对同种异体胰岛移植物的保护作用

目的探讨小鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)中转录激活因子5 (activating transcription factor 5,ATF5)促进肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)的表达及其对同种异体胰岛移植物的保护作用。方法半定量RT-PCR检测HSCs中ATF5 mRNA、TRAIL mRNA的表达水平,流式细胞术检测HSCs表面TRAIL蛋白质水平。慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染HSCs,针对ATF-5基因进行RNA干扰,半定量RT-PCR检测慢病毒感染的HSCs中ATF5 mRNA及TRAIL mRNA水平。单向混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)观察HSCs和慢病毒感染的HSCs对T细胞的增殖反应。分别将单纯胰岛、胰岛联合HSCs、胰岛联合慢病毒感染的HSCs移植到小鼠的肾包膜下,比较移植胰岛的存活时间。结果γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)上调HSCs中ATF5 mRNA和TRAIL mRNA水平(P<0.01),IFN-γ亦可上调HSCs表面TRAIL蛋白质水平。慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染HSCs后,HSCs中ATF5 mRNA水平明显下降(P<0.01),TRAIL mRNA水平亦下降(P<0.05)。IFN-γ作用于感染慢病毒的HSCs后,HSCs中ATF5 mRNA和TRAIL mRNA水平亦增加(P<0.01),但明显低于未被慢病毒感染的HSCs(P<0.01)。HSCs可明显抑制T细胞增殖反应(P<0.01),慢病毒感染的HSCs亦能抑制T细胞增殖反应(P<0.05),但抑制作用明显低于未被慢病毒感染的HSCs(P<0.01)。单纯胰岛移植组(A组)移植胰岛中位存活时间为11天;胰岛联合HSCs移植组(B组)移植胰岛中位存活时间为88天,B组胰岛移植物存活时间明显长于A组(P<0.01);胰岛联合慢病毒感染的HSCs移植组(C组)移植胰岛中位存活时间为18天,C组胰岛移植物存活时间长于A组(P<0.01),但明显短于B组(P<0.01)。结论小鼠HSCs中ATF5可促进TRAIL基因表达,表达TRAIL的HSCs可以抑制T细胞的增殖反应,此HSCs与胰岛细胞联合移植,明显延长小鼠同种异体胰岛移植物存活时间。

过氧化物酶体增殖物活化的受体γ特异配体罗格列酮对肝星状细胞生物学特性的影响

目的 研究过氧化物酶体增殖物活化的受体γ(PPARγ)特异配体罗格列酮对肝星状细胞(HSC)PPARγ 表达以及对HSC生物学特性的影响。 方法 设立空白对照组、3μmol L罗格列酮组、10μmol L罗格列酮组;分别 用RT PCR、Western印迹、免疫细胞化学方法检测PPARγ的表达;用Western印迹和免疫细胞化学方法检测α 平滑肌 肌动蛋白(α SMA)及Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达;四甲基偶氮唑盐(methythiazolyltetrazolium,MTT)法检测细胞增殖;流式细胞 仪分析细胞凋亡。 结果 10μmol L罗格列酮组HSC的PPARγmRNA表达明显高于对照组(t=10.87,P<0.01), PPARγ蛋白表达也明显高于对照组(t=4.627,P<0.01);10μmol L罗格列酮组HSC的增殖活性显著低于对照组(t ≥5.542,P<0.01),其α SMA及Ⅰ型胶原表达明显低于对照组(t≥4.627,P<0.01),其凋亡发生率显著高于对照组 (χ2=16.682,P<0.01)。 结论 PPARγ特异配体罗格列酮通过增加PPARγ的表达,能够抑制激活的HSC表达α SMA及Ⅰ胶原,抑制激活的HSC增殖,诱导激活的HSC凋亡。

PI3K抑制剂对四氯化碳刺激的肝星状细胞增殖和Ⅰ型胶原表达的影响

目的探讨PI3K抑制剂对四氯化碳(CCl4)刺激的肝星状细胞(HSC)增殖和Ⅰ型胶原表达的影响,为肝纤维化的治疗提供理论基础。方法将液氮保存下的HSC株,于37℃,50mL/L CO2孵育箱中复苏传代培养,同步化后将细胞分为5组:空白对照组、CCl4组、CCl4+1μmol/L PI103组、CCl4+2μmol/L PI103组、CCl4+4μmol/L PI103组,分别培养48h。用透射电子显微镜初步观察了细胞形态改变;MTT比色法测定细胞增殖情况;免疫细胞化学测定细胞的Ⅰ型胶原表达情况。结果 CCl4组与空白对照组比较,细胞生长旺盛,细胞数目增多,Ⅰ型胶原表达增多;透射电子显微镜下可见CCl4+4μmol/L PI103组比CCl4组凋亡细胞显著增多,细胞数目减少;MTT和免疫细胞化学实验结果显示,与CCl4组比较,CCl4+1μmol/L PI103组、CCl4+2μmol/L PI103组、CCl4+4μmol/L PI103组细胞的增殖和Ⅰ型胶原的表达均减少,随着PI103剂量加大,细胞的增殖和Ⅰ型胶原的表达均减少,但CCl4+4μmol/L PI103组和CCl4+2μmol/L PI103组比较,细胞的增殖无明显变化。结论 PI3K抑制剂PI103可抑制活化的HSC的增殖,促进其凋亡以及减少其Ⅰ型胶原的表达。

植物雌激素木黄酮对HSC-T6细胞增殖及雌激素受体表达的影响

目的研究植物雌激素木黄酮对体外培养的肝星状细胞(HSC-T6)的增殖、活化、胶原合成以及对雌激素受体(ER)表达的影响,探讨木黄酮抑制肝纤维化的作用机制。方法选择细胞系HSC-T6为体外细胞模型,随机分为4组,分别加入不同浓度的木黄酮(0.5、5、50μmol/L),同时设未加任何药物的空白对照组。作用24 h后采用MTT法检测HSC-T6细胞的增殖情况,放射免疫法测定细胞上清液Ⅲ型胶原(PCⅢ)、透明质酸(HA)的含量;免疫组化法观察木黄酮对各组HSC-T6细胞α-平滑肌肌动蛋白(-αSMA)及ER表达的影响。结果木黄酮各剂量组均不同程度地抑制HSC-T6细胞的增殖,降低其-αSMA的表达,减少PCⅢ及HA的分泌,且其抑制作用呈剂量依赖性;给予木黄酮后,HSC-T6细胞的ER表达增强,也呈剂量-效应关系。结论木黄酮可抑制体外培养的HSC-T6细胞的活化与增殖,减少细胞外基质的产生,抑制肝纤维化的形成。其作用机制可能与木黄酮增加HSC的ER表达有关。

基于“肝藏血”理论探究刺络泻血疗法对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝星状细胞凋亡的影响

目的：基于中医“肝藏血”理论，观察刺络泻血疗法对肝纤维化大鼠肝组织中肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSC）凋亡的影响，进而探究刺络泻血疗法治疗肝纤维化的作用机制。方法：SD大鼠40只随机分为四组（正常组、模型组、秋水仙碱组、刺血组），每组10只，除正常组外其余3组应用40％CCL4（花生油稀释）诱导肝纤维化模型。6周后，秋水仙碱组给予秋水仙碱200Hg／（kg·d），5次／周灌胃渖0血组选取下肢肝经血络刺血0．3-0．5mL。3次／周。12周后腹主动脉取血测定各组大鼠肝功ALT、AST水平；选取肝左叶小块肝组织石蜡包埋、切片，行Masson染色观察肝脏病理形态学改变；TUNEL法检测HSC的凋亡。结果：ALT、AST：与正常组比较，模型组大鼠血清ALT、AST水平均升高，差异具有统计学意义（P〈0．01）；与模型组比较，秋水仙碱组和刺血组大鼠血清ALT、AST水平均降低，其中刺血组与模型组大鼠血清AST水平差异具有统计学意义（P〈0．01）；秋水仙碱组与刺血组相比，刺血组大鼠血清ALT、AST低于秋水仙碱组，但差异无统计学意义（P〉0．05）。HSC凋亡情况：正常组HSC凋亡个数较少，其余各组HSC凋亡数目明显增多；与模型组比较，秋水仙碱组和刺血组HSc凋亡数目增多（P〈0．05，P〈0．01）；与秋水仙碱组比较，刺血组HSC凋亡数目更多（P〈0．05）。结论：刺络泻血疗法可有效防治大鼠肝纤维化，其作用机制可能与促进Hsc凋亡有关。

肝星状细胞的激活在大鼠小肝移植供肝损伤中的作用

目的: 在大鼠小肝移植模型的基础上,检测大鼠小肝移植中肝星状细胞的激活在供肝损伤中所起的作用.方法:建立大鼠小肝移植模型;按供肝与受体肝重量比,分全肝移植组和小肝移植组.观察两组7d生存率;术后6 , 48h处死大鼠,取下肝脏标本,应用αSMA抗体进行免疫组织化学染色以测定肝星状细胞(Hepaticstellatecell)的激活程度.结果:成功建立了大鼠小肝移植模型;全肝移植组和小肝移植组7d生存率分别为91. 7% (11 /12)和16. 7% (2 /12);两组间比较,在各时间点上,小肝移植组αSMA的表达均高于同一时间点全肝移植组αSMA的表达,表明小肝移植组HSC激活的程度总体上高于全肝移植组.结论: 在大鼠小肝移植中,肝星状细胞的激活与供肝的损伤密切相关.

胰腺星状细胞与胰腺纤维化

近年在胰腺组织中发现胰腺腺泡细胞周围存在着一种与肝星状细胞(HSC)形态、结构、功能相似的细胞,其被命名为胰腺星状细胞(PSC)。研究发现,PSC可以在多种因素的作用下活化,生成细胞外基质(ECM)成分,同时分泌细胞因子产生自身放大效应和复杂的网络调控,最终促进纤维化的形成。

库普弗细胞对肝星状细胞活化和增殖的影响

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,其形成过程可简单归纳为[1]:致肝病因子损伤肝细胞→库普弗细胞(KC)激活→分泌多种细胞因子(CK)→星状细胞(HSC)激活、增殖、转化为肌样成纤维细胞→产生大量细胞外基质(ECM)→合成大于降解并沉积→肝纤维化形成.

永生化人肝星状细胞株WM07的建立

目的以慢病毒载体介导猿猴病毒40(simian virus 40,SV40)大肿瘤抗原(large tumor antigen,TAg)转染原代人肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)获得永生化HSC株。方法以含SV40 TAg cDNA序列的SV40tsA58质粒为模板,PCR获取全长SV40 TAg序列,经TOPO克隆进入pENTR^(TM)TOPO~?载体,PCR鉴定获得pENTR-SV40 TAg Entrez质粒,再经LR重组反应将SV40 TAg cDNA克隆到目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST,PCR鉴定pLenti4/V5-GW/SV40 TAg质粒,进一步用该质粒转染工程细胞293FT进行假病毒包装,用含包装病毒的细胞培养上清液转染原代人HSC,经博来霉素筛选获得稳定表达SV40 TAg的人HSC株(命名为WM07),并对细胞进行SV40 TAg及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的检测和鉴定。结果对pENTR-SV40 TAg Entrez质粒及pLenti4/V5-GW/SV40 TAg慢病毒表达质粒进行PCR测序,结果证实所构建的质粒含ATG转录起始位点及SV40 TAg cDNA序列。对经过转染、筛选获得的WM07行免疫荧光染色,结果显示SV40 TAg在细胞核表达和定位,细胞质内均表达活化的HSC标志物α-SMA。结论 pLenti4/V5-GW/SV40 TAg质粒构建成功。经质粒转染,获得永生化HSC株WM07,可稳定传代并用于肝纤维化研究。

维生素E对CC1_4作用下HSC增殖和ECM影响

目的观察维生素E(VE)对四氯化碳(CC14)作用下大鼠肝星状细胞(HSC)增殖和细胞外基质(ECM)产生的影响。方法采用原位灌注方法分离大鼠HSC。结果CC14作用下大鼠HSC3H-脯氨酸(3H-Pro)的掺入显著增加,Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、透明质酸(HA)、板层素(LN)及纤维连接素(FN)的分泌水平明显提高。200nmol/LVE预处理4h可有效抑制CC14作用下大鼠HSC3H-胸腺密啶(3H-TdR)、3H-Pro的掺入,VE保护能使CC14作用下HSC分泌PCⅢ、HA、LN和FN减少与HSC产生丙二醛(MDA)下降,二者呈正相关。结论VE可抑制CC14作用下大鼠HSC增殖和通过抗氧化损伤抑制HSCECM的分泌。

甘草酸对转化生长因子β1刺激肝星状细胞信号传导的作用

目的探讨甘草酸对转化生长因子β1(TGF β1)刺激大鼠肝星状细胞(HSC)胞内信号传导通路的作用。方法体外分离、培养大鼠肝HSC,甘草酸与TGFβ1刺激的HSC共同孵育。逆转录聚合酶链反应法检测1-1000 μmol/L甘草酸对TGF β1刺激的HSC中Smad2、3、7 mRNA的表达;Western印迹法检测1-1000μmol/L甘草酸对TGF β1刺激的HSC中Smad2、3、7蛋白及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达水平。结果TGFβ1促进HSC中Smad2、3、7 mRNA及蛋白的表达,同时促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达。1-1000μmol/L甘草酸抑制Smad2、3、7 mRNA及蛋白的表达,并且抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达,均呈剂量依赖性。结论甘草酸可能通过干预大鼠HSC中TGFβ信号通路而减少胶原合成和发挥抗纤维化作用。

血管紧张素Ⅱ和醛固酮对肝星状细胞细胞外通路调控的体外研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(Aldo)对肝星状细胞(HSC)细胞外调节蛋白激酶(ERK)和激活蛋白1(AP1)信号转导通路的影响。方法采用HSCT6细胞株,分别予AngⅡ1μmol/L和Aldo1μmol/L处理,免疫Western印迹检测磷酸化P42/44蛋白水平。另外,观察AngⅡ1型受体(AT1受体)阻断剂伊贝沙坦(irbesartan),细胞外调节蛋白激酶(ERK)特异性抑制剂U0126,抗氧化剂乙酰半胱氨酸(NAC)、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和肿瘤坏死因子α(TNFα)对磷酸化P42/44蛋白水平的影响。电泳迁移率变更分析(EMSA)检测AP1DNA结合活性的变化;反转录聚合酶链反应检测α1Ⅰ型前胶原基因的表达。结果AngⅡ和Aldo可诱导磷酸化P42/44蛋白水平的变化,与阴性对照组的比值达4.3±0.1、4.0±0.1,并呈时间依赖性,10min达到峰值后逐渐减低。U0126可抑制磷酸化P42/44蛋白水平。irbesartan可抑制AngⅡ诱导的磷酸化P42/44蛋白水平。AngⅡ和Aldo可增强HSC的AP1的DNA结合活性。irbesartan和ACEI可显著抑制AP1的活性;U0126和NAC可以显著抑制AngⅡ诱导的AP1的活化,部分抑制Aldo诱导的AP1的活化。AngⅡ和Aldo可诱导α1Ⅰ型前胶原mRNA的表达。irbesartan、U0126和NAC可显著抑制AngⅡ诱导的α1Ⅰ型前胶原mRNA表达增强;U0126和NAC可显著抑制Aldo诱导的α1Ⅰ型前胶原mRNA表达增强。结论AngⅡ和Aldo可经ERK通路诱导HSCAP1结合活性增强。AngⅡ和Aldo可经AP1通路调控α1Ⅰ型前胶原基因的表达。

抗纤二号药物血清对活化型肝星状细胞的影响

为了解抗纤二号的抗肝纤维化作用机制,采用动物体内给药,分离药物血清,作用于体外培养细胞的血清药理学实验方法,探讨该方对肝星状细胞(HSC)激活的标志平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin, SMA)表达的影响及ⅠⅢ型胶原和转化生长因子β1(TGFβ1)及其下游信号Smad3表达的影响,从细胞分子学水平探讨该方抗肝纤维化的作用机制.

外源Smad7基因对原代肝星状细胞活性和基因表达调控的影响

目的研究外源Smad7基因对原代肝星状细胞(HSC)活性和基因表达调控的影响。方法采用胶原酶原位灌注、密度梯度离心法分离SD大鼠原代HSC,并予转化生长因子β1(TGFβ1)刺激,同时分别以重组腺病毒AdSmad7和对照病毒AdGFP感染原代HSC,RTPCR法检测TGFβ1、Smad3mRNA、Smad7mRNA在HSC中的表达,免疫细胞化学法检测HSC中α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和Smad7表达。结果RTPCR显示,与TGFβ1对照组比较,AdSmad7组Smad7mRNA表达显著上调(P<0.05),但TGFβ1和Smad3mRNA表达差异无统计学意义。免疫细胞化学染色显示,与其他各组比较,AdSmad7组HSC胞质中Smad7表达最高,αSMA表达则明显降低(P<0.01)。结论重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7可在HSC中高效表达;外源Smad7基因可阻断TGFβ1对HSC的活化作用,但对Smad3和TGFβ1mRNA表达无明显影响。

抗肝纤维化治疗的共识与争议

肝纤维化是肝细胞发生炎症坏死时，肝内纤维结缔组织的异常增生，它不是一个独立的疾病，而是许多慢性肝病（如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝等）的共同病理过程。目前认为，肝星状细胞（HSC）的活化、细胞外基质（ECM）的合成与降解失衡导致ECM在细胞间质的过度沉积是肝纤维化发生的基本机制。抗肝纤维化治疗包括两个方面：一是针对原发病的病因治疗，如抗病毒治疗、抗血吸虫治疗、戒酒、祛铁和祛铜等；二是针对肝纤维化本身的治疗，如抑制HSC的早期活化、增殖、收缩和胶原增生，促进HSC凋亡及促进胶原降解等。