应用激光扫描共聚焦显微成像术研究光敏剂亚细胞定位

目的应用激光扫描共聚焦显微成像系统及荧光定量分析方法,探讨血卟啉单甲醚(HMME)在靶细胞亚细胞结构中的精确定位及定量分析的可行性。方法将传代培养的鼠肺内皮细胞与HMME共同孵育24h。应用激光扫描共聚焦显微成像系统,选择特异性细胞器荧光探针若丹明(rhodamine)-123、荧光素黄(luciferyellow)、DiOC6(3)和BODIPY分别标记细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体。采取不同的采集顺序激发染色细胞样品,通过预先设置的相应的发射滤光片分别采集细胞内HMME与细胞器探针的荧光图像。通过计算机图像处理,采用像素-荧光强度分析方法对光敏剂进行亚细胞定位。结果采用先激发探针后激发HMME的顺序,HMME及荧光探针的荧光强度及形态特征保持较好;细胞质与细胞核内HMME平均荧光光强差异有显著意义,前者是后者的2倍以上;HMME在4种细胞器区域平均荧光光强与细胞平均荧光光强(J1/J2)比值的差异有显著意义;随参数m的增高,HMME在4种细胞器区域J1/J2比值呈下降趋势。结论HMME在细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体均有分布;应用激光共聚焦显微成像系统结合荧光定量分析法能对荧光效率极低的光敏剂进行精确的亚细胞定位及分布定量比较。

面向下一代数字病理成像分析仪的高通量全彩色傅里叶叠层显微成像术(特邀)

傅里叶叠层显微成像术是近年来提出的新型计算成像技术,它有效解决了传统显微成像中分辨率与视场制约的问题,无需对样本进行机械扫描便能获得十亿像素级的高通量图像,有效解决传统数字病理扫描仪器的拼接伪影、重影、拼接成功率低、景深狭小、效率偏低等问题。近年来更是发现其不单是解决视场与分辨率制约的工具,更是解决一系列权衡问题的范式,从而迸发出源源不绝的生命力与应用潜力。本文全方位概述了傅里叶叠层显微成像术技术9个方面的发展趋势,简介了其起源与基本原理,着重综述了其在面向下一代数字病理成像分析仪的多个阶段与最新进展。指出其在这一应用方向上已进入“10-100”的产业化阶段。讨论了其产生大规模社会经济效益的可能性,其极有可能给数字病理行业及其上下游相关行业带来突破进展。尽管如此,作为典型交叉领域仍有不尽人意之处,包括科学问题、技术问题、工程问题及行业问题,需要多方共同努力推进,展望了未来技术与工程发展方向。

现代显微成像技术及其在细胞生物学中的应用

具有高分辨率、能活体观察和三维成像的现代显微成像技术的产生和发展,为细胞生物学研究提供了有效的工具。我们在本文中阐述了几个重要的现代显微成像技术原理和技术要点以及在细胞生物学中应用的现状,包括光学显微术、电子显微术和荧光探针技术及相关技术,并对现代显微成像术的发展进行了展望。

表面性质对扫描力显微术成像的影响

利用微接触印刷的方法制备了图形化的自组装膜。考察了膜的表面性质对接触式原子力显微镜（ＡＦＭ），摩擦力显微镜（ＦＦＭ）和剪切力显微镜（ＳＦＭ）的成像的影响。发现ＡＦＭ能反映样品的表面形貌，而ＦＦＭ和ＳＦＭ的成像受表面性质的影响较大，在表面性质差别很大的图形表面上会出现图像衬度与表面形貌反转的现象。

二组分荧光寿命成像显微术的研究

用ＭｏｎｔｅＣａｒｌｏ方法研究了激发光的调制频率、ＣＣＤ所记录到的光强度、荧光寿命的大小以及权值对二组分荧光寿命成像显微术的频域外差法测量及数据处理精度的影响，提出了改进测量精度的方法，如选择合适的调制频率和染料，使调制频率ω和荧光寿命τ满足（１４）和（１５）式；增大ＣＣＤ的积分时间等。

混浊介质荧光显微成像的层析能力研究

采用蒙特卡罗方法给出了混浊介质显微成像中 ,共焦荧光、双光子激发荧光的空间分布。该分布表明双光子激发荧光显微成像具有内在的轴向层析能力 ,而共焦荧光成像的轴向层析能力依赖于共焦针孔的采用。

荧光共振能量转移显微术及其新进展

本文叙述荧光共振能量转移显微术及荧光寿命成像显微术的原理、方法及特点。同时介绍利用荧光共振能量转移显微术研究信号分子Rac蛋白在3T3成纤维细胞内的定位及活化过程,以及利用荧光共振能量转移—荧光寿命成像显微术研究转录因子CAATT/增强子结合蛋白α在小鼠垂体细胞内的二聚化现象。

亚细胞结构的超高分辨成像研究

本文介绍了3种常用的亚细胞结构成像技术包括荧光超分辨显微成像术、软X-射线显微镜和三维冷冻电镜的成像原理,细胞成像应用及所存在的问题。并提出多种显微镜联用的关联显微术由于结合了多种显微镜的优势,能够提供多方位信息,丰富细胞生物学的研究,有可能给细胞学带来全新的认识。

利用荧光蛋白示踪脑微血管内皮细胞微丝的动态变化

目的利用活细胞显微成像术对脑微血管内皮细胞内肌动蛋白的动态变化实现实时观察。方法构建绿色荧光蛋白(GFP)标记Lifeact的真核表达载体即Lifeact-pEGFP,利用脂质体转染法将Lifeact-pEGFP质粒转染至脑微血管内皮细胞中,利用共聚焦激光扫描显微镜对Lifeact-pEGFP在细胞内的分布进行分析,并检测其在细胞伸展和迁移过程中的动态变化。结果成功将Lifeact-p EGFP质粒转染至人脑微血管内皮细胞,细胞存活未受到影响。Lifeact-pEGFP能将活细胞中的肌动蛋白丝标记为绿色荧光,并能够有效监测细胞伸展和迁移过程中肌动蛋白丝的动态变化。结论 Lifeact-p EGFP转染结合活细胞显微成像术可以用于实时记录和分析脑微血管内皮细胞内肌动蛋白丝的动态变化。

基于光学成像技术的针灸镇痛机理研究

疼痛治疗是一个医学难题。虽然人们对痛觉感受机理的认识已达到细胞分子水平,但现代医学疗法对疼痛尤其是慢性疼痛的治疗仍无良策。针灸镇痛疗法因副作用小、疗效好而逐渐获得西方认可。尽管针灸镇痛在临床上得到了验证,但是其机理尚未明确。正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和功能核磁共振成像(fMRI)、免疫组织化学等技术已被应用于针灸镇痛机理的研究。然而,这些技术在分辨率或无损检测等方面存在局限性,限制了它们在针灸镇痛机理研究中的进一步应用。介绍了采用光学成像技术研究针灸镇痛的机理,其中重点评述激光扫描共聚焦显微成像术、光学相干层析成像术及活体动物光学成像术在针灸镇痛机理研究中的应用。

多维时间相关单光子计数在生物医学中的应用(英文)

传统的时间相关单光子计数(Time-correlated single photon counting, TCSPC)受计数率低、一维测量和采集时间长的限制,难以在生物医学中的推广.评述TCSPC的机理和应用,指出TCSPC是探测周期光信号内的单个光子、测量光子探测时间以及构建信号周期内光子分布与时间关系的一种技术,具有多维光子采集特性,计数率近似当前可用的探测器容量.该技术可采集光子对波长和空间座标的分布,时间尺度在皮秒量级,在实验开始时可进行二次计数.多维TCSPC技术拥有近似于理想的计数效率,其时间分辨率仅受探测器渡越时间的离散限制.故TCSPC在生物医学光谱学中极具应用价值.典型应用包括,时域光学X线断层照相、记录生物系统内的瞬态现象、荧光寿命成像显微术、活细胞内荧光共振能量转移实验,以及用荧光关联谱探索染料-蛋白复合体.

大鼠早期急性心肌缺血中的荧光成像和光谱分析

采用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法建立急性心肌缺血模型,通过双光子荧光显微成像技术(TPEF)获取左心室前壁不同缺血时间的图象,得到心肌在不同缺血时间情况下的双光子荧光图像及其光谱图像。从荧光图像中得到不同时刻形态学信息及心肌细胞代谢信息;从光谱图像中分析心肌缺血组织物质成分。

青蒿琥酯诱导活性氧依赖性的细胞凋亡

一般认为青蒿琥酯（ART）引起细胞凋亡是因为产生了活性氧（ROS）,从而启动多种凋亡途径。利用荧光染料2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和罗丹明（Rhodamine）123分别表征细胞中ROS的水平以及线粒体的膜电位,然后采用动态显微荧光成像技术在单个活细胞中实时监测ART诱导人类肺腺癌细胞（ASTC-a-1）凋亡过程中ROS的产生和线粒体膜电位的下降。结果显示0~50μg/mL质量浓度的ART均能引起细胞活力的降低,40μg/mL质量浓度的ART能明显产生ROS,并且引起细胞线粒体膜电位的显著下降;CCK-8试剂对细胞活性的检测结果表明,ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可以显著抑制ART诱导的细胞凋亡和线粒体膜电位下降,证明ART诱导了ROS依赖性的细胞凋亡和线粒体膜电位下降。