反义及显性负调节AKT2 RNA对脑胶质瘤细胞增殖抑制作用的体外研究

背景与目的:表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)下游的丝苏氨酸激酶2(serine/threoninekinase2,AKT2)信号转导通路对肿瘤细胞的生存和凋亡具有十分重要的作用。本文研究了反义AKT2(antisenseAKT2,AS-AKT2)和显性负调节AKT2(dominant-negativeAKT2,DN-AKT2)构建体对人脑胶质瘤细胞系TJ905的增殖和凋亡的调控作用。方法:脂质体介导AKT2构建体转染人脑胶质瘤细胞系TJ905,原位杂交和蛋白印迹法检查AKT2的表达水平,Ki-67标记指数和MTT法检测细胞增殖能力,TUNEL法计算凋亡指数评价肿瘤细胞凋亡的变化。结果:对每种AKT2构建体转染后随机选择3个扩增后进一步分析。原位杂交和蛋白印迹结果表明,转染AS-AKT2后AKT2表达显著抑制,转染DN-AKT2后AKT2表达无明显变化。MTT研究发现:AS-AKT2组和DN-AKT2组的6天细胞生存率分别为(49.30～51.46)%和(50.52～55.23)%,细胞存活率显著低于对照组和空载体组(P<0.001);AS-AKT2组和DN-AKT2组的标记指数(Ki-67labelingindex,Ki-67LI)分别为(57.50～59.33)%和(59.17～61.00)%,明显低于对照组(76.50%)和空载体组(74.83%)(P<0.001);TUNEL法凋亡分析表明:对照组和空载体组几乎没有凋亡细胞,AS-AKT2组(8.33%～8.83%)和DN-AKT2组(7.50%～7.83%)

显性负性突变体对AP2α转录因子及其活性的影响

转录蛋白2α(activator protein-2α,AP2α)的转录活性可能是全反式视黄酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)促进骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)神经分化的关键调控点,但具体机制尚不清楚,显性负性突变是研究基因功能的一个经典手段.以携带AP2α全长基因的pAd-AP2α质粒为模板,分别扩增缺失bHLH及缺失TAD区域的AP2α片段,采用AdEasy腺病毒包装系统获得两种AP2α缺失型显性负性突变体重组腺病毒Ad-dnAP2α-△bHLH及Ad-dnAP2α-△TAD,腺病毒感染ATRA诱导24 h的大鼠MSCs可观察到60%以上RFP阳性细胞.Real-time-PCR、Western blot及免疫荧光结果显示AP2α定位于MSCs细胞核,经A-TRA诱导24 h,AP2α的表达无变化,而其下游基因bcl-2及c-kit表达增高,两种缺失型显性负性突变体腺病毒感染MSCs对野生型AP2α的mRNA及蛋白表达没有影响,却能有效抑制AP2α对下游靶基因bcl-2和c-kit的转录激活作用.为进一步研究AP2α转录活性在ATRA诱导MSCs成神经分化中的作用提供重要的分子手段.

人表皮生长因子受体显性负性突变体对胃癌细胞体外侵袭转移能力的抑制作用

目的:探讨人表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)显性负性突变体(Dominant negative epidermalgrowth factor receptor,DNEGFR)对胃癌细胞体外侵袭转移能力的影响及其分子机制。方法:构建pEGFPN1-DNEGFR,转染人胃癌细胞并筛选稳定转染株,采用Transwell侵袭小室模型检测人胃癌细胞体外侵袭转移能力,RT-PCR检测细胞基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)mRNA水平,酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测培养液MMP-2和MMP-9蛋白水平。结果:成功构建pEGFPN1-DNEGFR,转染并筛选出稳定转染株,检测到人胃癌细胞体外侵袭转移能力降低,细胞MMP-2和MMP-9 mRNA水平降低,培养液MMP-2和MMP-9蛋白水平降低。结论:DNEGFR通过抑制人胃癌细胞分泌MMP-2和MMP-9,使其体外侵袭转移能力显著降低,将为DNEGFR在胃癌生物治疗中的深入研究打下基础。

人EGFR显性负性突变体负调控内源性EGFR功能的机制分析

通过定向克隆法构建真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR,脂质体介导下转染体外培养的SGC-7901细胞,应用Western blotting检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达,激光共聚焦显微镜对DNEGFR-EGFP亚细胞结构定位检测;并经RT-PCR、Western blotting检测DNEGFR-EGFP对内源性EGFRmRNA水平、蛋白及磷酸化水平的影响.成功检测到DNEGFR-EGFP蛋白的表达,DNEGFR-EGFP蛋白主要定位于细胞膜,DNEGFR-EGFP能降低内源性EGFR蛋白磷酸化水平,而对内源性EGFRmRNA水平及蛋白水平无影响.研究证明DNEGFR通过降低内源性EGFR蛋白磷酸化水平负调控EGFR功能,为靶向EGFR显性负性策略在肿瘤生物治疗中的进一步研究打下基础.

人EGFR显性负性突变体真核表达载体的构建、蛋白表达及亚细胞结构定位

目的:构建人EGFR显性负性突变体真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR,转染COS-7细胞,检测DNEGFR-EGFP的表达并进行亚细胞结构定位.方法:将RT-PCR(reverse tran-scription-polymerase chain reaction)方法扩增得到编码EGFR信号肽段、胞外区和跨膜区的cDNA,定向克隆至空载体pEG-FP-N1中,构建真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR.经PCR扩增鉴定、双酶切鉴定、核苷酸序列测定以及生物信息学分析证明pEGFPN1-DNEGFR构建成功后,脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,Western Blot检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达,应用光谱激光扫描共聚焦显微镜对DNEGFR-EGFP亚细胞结构定位检测.结果:PCR扩增鉴定、双酶切鉴定、核苷酸序列测定以及生物信息学分析证实pEGFPN1-DNEGFR构建成功,并且Western Blot检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达,光谱激光扫描共聚焦显微镜观察显示DNEGFR-EGFP蛋白主要定位于细胞膜.结论:成功构建人EGFR显性负性突变体真核表达载体,并在COS-7细胞胞膜上表达,为靶向EGFR显性负性策略在肿瘤基因治疗中的进一步研究打下基础.

人表皮生长因子受体显性负性突变体诱导胃癌细胞发生G0／G1期阻滞

目的:探讨人表皮生长因子受体显性负性突变体(dominant negative epidermal growth factor recep-tor,DNEGFR)对胃癌细胞细胞周期的影响及其分子机制。方法:选用2株人胃癌细胞,分为如下6组:SGC-7901细胞未转染组(US组)、SGC-7901细胞pEGFP-N1质粒转染组(ES组)、SGC-7901细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DS组)、NCI-N87细胞未转染组(UN组)、NCI-N87细胞pEGFP-N1质粒转染组(EN组)和NCI-N87细胞pEGF-PN1-DNEGFR质粒转染组(DN组)。采用流式细胞术检测细胞周期,Western blotting检测细胞周期素依赖性蛋白激酶2(CDK2)、cyclin D1、Ser9位点磷酸化糖原合成酶激酶3β[p-GSK-3β(Ser9)]、p21和p27蛋白水平。结果:转染pEGFPN1-DNEGFR质粒的人胃癌细胞株出现G0/G1期阻滞,CDK2、cyclin D1和p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平降低,p21和p27蛋白水平则升高。结论:DNEGFR通过激活GSK-3β使cyclin D1蛋白水平降低,并降低CDK2蛋白水平,上调p21和p27蛋白水平,最终导致胃癌细胞发生G0/G1期阻滞。这一结果将为胃癌生物治疗研究提供新思路。

VP22融合型显性负性突变体抑制乙肝病毒复制

目的了解VP22融合型显性负性(DN)突变体对抑制乙肝病毒(HBV)复制的作用.方法将VP22全长及其不同区段融合于HBV核心蛋白(HBc)的C端,克隆入pcD-NA3.1(-)构成DN突变体真核表达质粒.转染HepG2.2.15细胞后,免疫荧光鉴定DN突变体在细胞内的表达,并以培养上清HBV表面抗原(HBsAg)的浓度为指标,观察DN突变体对HBV病毒复制的抑制效应.同时以MTT比色法观察转基因的表达对宿主细胞生长状态的影响.结果VP22及其不同区段构建的DN突变体可在HepG2.2.15细胞中进行表达,且对宿主细胞无毒性.VP22融合型DN突变体可有效地抑制HBV的复制,具有蛋白转导特性的DN突变体比无转导特性的DN突变体具有更强的抗病毒能力.其中VP22全长构成的DN突变体具有最强的抑制效应,可使上清HBsAg浓度下降81.94%.结论VP22融合型DN突变体可以增强DN突变体对HBV复制的抑制.

显性负突变存活素质粒的构建

目的构建显性负突变存活素质粒。方法从大鼠心脏微血管内皮细胞中提取总RNA,反转录成cDNA后,利用巢式PCR扩增存活素基因全序列,并引入酶切位点,利用重叠PCR对存活素基因进行定点突变,然后与带绿色荧光的真核表达载体pEGFP-N3进行重组,经测序鉴定后转染细胞,观察对细胞凋亡的影响。结果用巢式PCR扩增出含存活素基因的496 bp产物,和引入酶切位点后的452 bp产物。通过重叠PCR 3次PCR反应,得到452 bp大小的定点突变产物。重组载体经测序鉴定表明插入片段无误,转染细胞后能发出明亮的绿色荧光,Hochest染色显示细胞凋亡比空质粒对照组显著。结论成功构建了显性负突变存活素质粒。

VPS4B显性负性突变体抑制乙型肝炎病毒复制

目的观察细胞液泡蛋白质分选因子4B(VPS4B)显性负性突变体VPS4B-K180Q在体外抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制的效应。方法用不同剂量野生型VPS4B真核表达质粒pXF3H-VPS4B和K180Q突变型真核表达质粒pXF3H-K180Q与pHBV1.3共转染Huh7细胞,时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)定量检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg含量,Southernblot分析细胞内HBV核衣壳相关DNA水平,实时定量PCR检测HBV相关mRNA水平变化。结果野生型VPS4B可抑制HBsAg和HBeAg的分泌,对细胞内HBV核衣壳相关DNA和mRNA的抑制作用较弱;低剂量突变型VPS4可显著抑制HBsAg和HBeAg的分泌,对细胞内HBV核衣壳相关DNA和mRNA的抑制作用较强,且均呈剂量依赖的抑制效应。结论 VPS4B及其显性负性突变体可在体外表现出抗HBV的作用,突变型VPS4B抑制HBV能力高于野生型VPS4B。

人EGFR显性负性突变体抑制胃癌细胞促血管形成能力

目的探讨人表皮生长因子显性负性突变体(dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR))对胃癌细胞促血管形成能力的影响及其分子机制,并检测其对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法选用2株人胃癌细胞,分为如下6组:SGC-7901及NCI-N87细胞未转染组(US组,UN组),SGC-7901及NCI-N87细胞pEGFP-N1质粒转染组(ES组,EN组),SGC-7901及NCI-N87细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DS组,DN组)。采用人脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cell,HUVEC)管腔结构形成实验检测体外促血管形成能力,采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞培养液中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平,建立人胃癌细胞裸鼠移植瘤模型,标本微血管密度(microvessel density,MVD)检测体内促血管形成能力,标本体积检测其对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。结果转染pEGFPN1-DNEGFR质粒的人胃癌细胞株出现HUVEC管腔结构形成抑制,培养液中VEGF水平降低,MVD计数降低,裸鼠皮下移植瘤体积变小。结论 DNEGFR可能通过下调VEGF分泌抑制胃癌细胞体外及裸鼠体内促血管形成能力,最终抑制裸鼠皮下移植瘤生长。

IκBα显性负相重组慢病毒载体的构建及其在NF-κB信号通路中的功能验证

目的:构建表达IκBα显性负相结构(dominant-negative construct,IκBα-DN)的重组慢病毒载体,并检测其对核转录因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的影响。方法:PCR扩增IκBα-DN片段并插入至p CDHCMV-MCS-EF1-cop GFP载体中。将构建的p CDH-IκBα-DN重组质粒与包装质粒ps PAX2和包膜质粒p MD2.G共同转染293 T细胞,包装表达IκBα-DN的重组慢病毒,并用梯度稀释法检测病毒滴度。以慢病毒IκBα-DN感染293 T细胞,通过免疫印迹检测IκBα蛋白的表达量。将慢病毒IκBα-DN感染已转染有NF-κB虫荧光素酶报告质粒的293 T细胞,24 h后检测IκBα-DN对NF-κB活性的影响。进一步用慢病毒IκBα-DN感染表达卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒FLICE抑制蛋白(viral FLICE inhibitory protein,v FLIP)的人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),以检测IκBα-DN在NF-κB信号通路中的功能。结果:限制性内切酶鉴定以及核酸序列比对证实重组质粒p CDH-IκBα-DN构建成功。通过三质粒包装系统包装表达IκBα-DN的重组慢病毒,病毒滴度约为3×107efu/m L。以慢病毒IκBα-DN感染293 T细胞,免疫印迹结果表明胞质中IκBα蛋白的表达量明显升高。虫荧光素酶报告实验结果提示,重组慢病毒介导的IκBα-DN能有效抑制NF-κB的活性。在表达KSHV v FLIP的HUVECs中,IκBα-DN也能显著减弱NF-κB通路信号。结论:成功构建的含IκBα-DN序列的慢病毒能够有效地感染293 T细胞和内皮细胞,且初步结果提示IκBα-DN能增加胞质内IκBα的含量,并进一步抑制NF-κB信号的传递。

端粒酶逆转录酶显性负突变体对乳腺癌细胞端粒酶活性的抑制作用

目的:观察端粒酶逆转录酶显性负突变体(DN-hTERT)对乳腺癌细胞MCF7端粒酶活性的抑制作用。方法:将携带DN-hTERT基因的真核表达载体IRES2-EGFP空载体通过脂质体2000介导转入MCF7细胞,以G418进行稳定筛选,得到阳性克隆;倒置荧光显微镜观察转染细胞的生长情况;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞hTERT mRNA的表达;TRAP-ELISA方法检测转染细胞端粒酶活性。结果:MCF7细胞转染DN-hTERT后生长受到抑制;转染DN-hTERT的MCF7细胞(MCF7/DN)hTERT mRNA表达升高;改进端粒重复序列扩增法(TRAP-ELISA)检测MCF7/DN细胞端粒酶活性与转染空载体MCF7细胞(MCF7/I)比较显著降低(P<0.05)。结论:DN-hTERT能特异性抑制MCF7细胞生长和端粒酶活性。

人EGFR显性负性突变体对胃癌细胞在裸鼠体内成瘤性及淋巴结转移的影响

为了研究人表皮生长因子显性负性突变体(dominant negative mutant of EGFR,dnEGFR)对胃癌细胞体内成瘤及淋巴结转移的影响,用目的质粒pEGFPN1-dnEGFR,空质粒载体pEGFP-N1分别转染胃癌细胞NCI-N87.筛选出稳定转染株,实验共分3组:NCI-N87细胞未转染组(untreated NCI-N87,UN组),NCI-N87细胞pEGFP-N1转染组(EN组);NCI-N87细胞pEGFPN1-dnEGFR转染组(DN组).将3组细胞接种于裸鼠右后足垫,6周后测量移植瘤大小及对应腹股沟转移淋巴结数目,HE染色验证,real-time PCR和Western印迹检测3组细胞中AKT1、MAPK3 mRNA和蛋白的表达改变.结果发现,DN组移植瘤较UN、EN组明显缩小(P<0.05),且右腹股沟转移淋巴结数目较UN、EN组减少(P<0.05).DN组细胞中,AKT1、MAPK3 mRNA和蛋白水平较UN、EN组降低(P<0.05).提示pEGFPN1-dnEGFR可抑制裸鼠体内胃癌细胞成瘤及淋巴结转移,AKT1及MAPK3信号通路可能参与其中.

Stat3显性负性基因调控人结肠癌细胞增殖与凋亡的分子机制

目的探讨转染Star3(转录信号传导子和激活子3)显性负性基因Star3β质粒阻断人结肠癌细胞系SW480细胞的Stat3信号传导通路对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制。方法应用阳离子脂质体向人结肠癌细胞系SW480细胞中转染携带Stat3β基因的质粒,四唑盐法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,反转录聚合酶链反应检测Stat3靶基因cyclin D1、bcl-xL mRNA表达情况。数据统计分析采用独立样本t检验。结果转染Stat3β质粒36 h后, SW480细胞的增殖受到显著抑制(t=5．216,P=0．006);G0／G1期的细胞比例由40．37％上升至67．25％,S期细胞由44．68％下降至31．23％;发生早期凋亡的细胞比例由5．34％上升至24．42％;同时cyclin D1、bcl-xL mRNA表达水平较对照组显著下降(t=5．228,P=0．010;t=3．517,P=0．025)。结论转染携带Stat3β基因的质粒可以通过下调Stat3靶基因的表达抑制人结肠癌细胞的增殖,促进凋亡,为以Star3为靶点的结肠癌基因治疗提供了实验基础。

成纤维细胞生长因子1型受体-显性负性作用对骨髓基质干细胞成骨诱导培养后碱性磷酸酶活性的影响

目的探讨成纤维细胞生长因子1型受体-显性负性作用（FGFR1-DN）对骨髓基质干细胞（BMSCs）成骨诱导培养后碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法真核表达质粒pcDNA3．1（＋）．DNFGFR1、pcDNA3．1（＋）．FGFR1转染BMSCs，实验分为FGFR1-DN转染组、FGFR1转染组、空载体转染组和未转染组。细胞对数生长期进行成骨诱导培养后检测ALP的活性，定性检测采用免疫组化方法，定量检测采用细胞内ALP（cALP）试剂盒。比较4组细胞诱导培养7、14d的ALP活性。结果与诱导培养7d比较，4组14d后ALP活性评分均明显增高，但FGFRl．DN转染组评分增高最明显，差异有统计学意义（P〈0．05）。7、14d FGFR1-DN转染组ALP活性评分最高，FGFR1转染组最低，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论FGFR1-DN可促进BMSCs成骨期ALP的活性，为实现局部基因治疗与组织工程的联合应用及构建生物相容性更理想的组织工程骨提供了实验理论依据。

利用显性负模型研究整合素β3胞浆段RGT序列对信号转导的调控机制

该研究探讨整合素β3胞浆段RGT序列在整合素信号转导中的作用。利用IL-2R胞外段和跨膜段(Tac)与整合素β3胞浆段全长或截短序列构建Tac-β3嵌合体,即Tac-β3和Tac-β3Δ759,使其分别在表达GPIbIX、整合素αIIbβ3的CHO细胞株(IbIX/IIbIIIa-CHO细胞株)中稳定表达(即IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-β3、IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-β3Δ759细胞株)。利用竞争酶联免疫法对Tac-β3嵌合体进行定量,观察IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-β3、IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-β3Δ759细胞株在固相化纤维蛋白原上的伸展情况(代表外向内的信号转导);Co-IP研究Tac-β3嵌合体、β3与下游信号分子Src的结合情况。结果发现:竞争酶联免疫法证实了两个细胞株的Tac-β3嵌合体表达都高于野生型β3,保证了Tac-β3嵌合体对内源性β3在结合胞内分子中的显性负效应;IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-β3细胞株在固相化纤维蛋白原上的黏附伸展能力受到抑制,而IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-β3Δ759细胞株在固相化纤维蛋白原上的黏附伸展能力并未受到明显影响。Co-IP结果显示:Tac-β3能结合内源性Src,而胞浆段RGT序列缺失的Tac-β3Δ759则不与内源性Src结合。选择性地破坏Tac-β3的Src结合能力即足以去除其对外向内信号转导的显性负效应,从而表明:整合素β3尾端RGT序列与Src的相互作用在这一信号转导通路中起决定性的作用。

人表皮生长因子受体显性负性突变体对胃癌细胞体外生长能力的影响

目的探讨人表皮生长因子受体显性负性突变体(dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR)对人胃癌细胞体外生长能力的影响及其分子机制。方法用质粒pEGFPN1-DNEGFR转染人胃癌NCI-N87和SGC-7901细胞,并筛选稳定转染细胞株;采用MTT法检测人胃癌细胞体外生长能力,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记[terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)mediated deoxyuridine triphosphate(dUTP)nick-end labeling,TUNEL]法检测细胞凋亡情况,ELISA法检测胞浆中活性caspase-3蛋白水平,Western blot法检测ser 9位点磷酸化糖原合成激酶-3β[phosphorylated glycogen synthase kinase-3 beta,pGSK-3β(ser 9)]蛋白表达水平。结果成功筛选出4株稳定转染细胞株;质粒pEGFPN1-DNEGFR分别转染的NCI-N87和SGC-790细胞体外生长能力均降低,凋亡指数(apoptotic index,AI)均升高,胞浆中活性caspase-3蛋白水平均升高,pGSK-3β(ser 9)蛋白水平均降低,与对应的空质粒转染组及未转染组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 DNEGFR通过caspase相关的凋亡信号转导通路及糖原合成激酶-3β(GSK-3β)促凋亡作用诱导胃癌细胞凋亡,使其体外生长能力明显降低,为DNEGFR在胃癌生物治疗中的深入研究提供了部分理论依据,为胃癌的生物治疗提供了新思路。

转染IκB激酶2的显性负性突变体的受者树突状细胞诱导产生的CD4＋CD25-T细胞延长肾移植大鼠生存时间的研究

目的 探讨转染Adv-IκB激酶2的显性负性突变体（IKK2dn）基因并负载供者抗原的受者树突状细胞（DC）诱导产生的CD4＋ CD25-T细胞回输是否延长同种异体肾移植大鼠的存活时间,并探讨其机制.方法 获取和培养受者Lewis大鼠骨髓源性DC,转染IKK2dn基因并负载BN大鼠可溶性抗原,与BN大鼠的T细胞初次混合淋巴细胞反应（MLR）,72 h后采用免疫磁珠分选法筛选CD4＋ CD25-T细胞.肾移植受者为Lewis大鼠,分为初始T细胞组、Adv0-CD4＋T细胞组、CD4＋CD25-T细胞组、排斥组,术前7d分别输注1×107个初始CD4＋T细胞、Adv-0-DC诱导产生的CD4＋ CD25-T细胞、Adv-IKK2dn-DC诱导产生的CD4＋ CD25-T细胞和等量生理盐水,供者均为BN大鼠.另设第三方供者组,术前处理同治疗组,供者为Wistar大鼠.移植术后观察各组大鼠存活时间和发生排斥反应;测定受者T淋巴细胞增殖能力;检测血清白细胞介素（IL）-2、IL-10、γ-干扰素（IFN-γ）以及转化生长因子-β（TGF-β）表达水平;监测血肌酐（Cr）水平;病理学检查评定排斥级别.结果 CD4＋ CD25-T细胞组肾移植大鼠生存时间为（28.50 ±2.36）d,较其他各组显著延长（P＜0.01）;与其他各组比较,CD4＋ CD25-T细胞组表达高水平IL-10和TGF-β（P＜0.05）;与排斥组、Adv0-CD4＋T细胞组、第三方供者组比较,CD4＋ CD25-T细胞组低表达IL-2和IFN-γ（P＜0.05）;CD4＋ CD25-T细胞组T淋巴细胞的增殖能力明显低于其他4组（P＜0.05）;病理学检查CD4＋CD25-T细胞组发生排斥反应的病理级别较低.结论 转染IKK2dn基因并负载供者抗原的受者DC诱导产生的CD4＋ CD25-T细胞回输可以延长同种异体肾移植大鼠生存时间,并具有针对供者的特异性,其机制可能与诱导的IL-10、TGF-β的高分泌有关.

利用酵母功能检测技术筛选肝癌组织p53基因显性负抑制效应突变体

p5 3突变体的显性负抑制效应(dominant negative effect)是指突变型p5 3蛋白抑制细胞内野生型p5 3蛋白发挥正常功能的一种特性,是肿瘤发生的重要原因之一.利用酵母中分离的等位基因功能分析技术(functional analysis of separated alleles in yeast,FASAY)建立了一种简便稳定的p5 3突变体显性负抑制效应检测和筛选方法,并应用于检测2 8例原发性肝癌组织(HCC)样本的p5 3单点突变体,发现了1 2例为显性负抑制效应突变体,其中突变位点Met2 4 6Val为首次报道具有显性负抑制效应.进一步分析这些突变p5 3蛋白的结构,发现这些具有显性负抑制效应的突变位点大多位于p5 3蛋白表面与DNA特异性序列相互作用的区域.