成纤维细胞生长因子1型受体-显性负性作用对骨髓基质干细胞成骨诱导培养后碱性磷酸酶活性的影响

目的探讨成纤维细胞生长因子1型受体-显性负性作用（FGFR1-DN）对骨髓基质干细胞（BMSCs）成骨诱导培养后碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法真核表达质粒pcDNA3．1（＋）．DNFGFR1、pcDNA3．1（＋）．FGFR1转染BMSCs，实验分为FGFR1-DN转染组、FGFR1转染组、空载体转染组和未转染组。细胞对数生长期进行成骨诱导培养后检测ALP的活性，定性检测采用免疫组化方法，定量检测采用细胞内ALP（cALP）试剂盒。比较4组细胞诱导培养7、14d的ALP活性。结果与诱导培养7d比较，4组14d后ALP活性评分均明显增高，但FGFRl．DN转染组评分增高最明显，差异有统计学意义（P〈0．05）。7、14d FGFR1-DN转染组ALP活性评分最高，FGFR1转染组最低，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论FGFR1-DN可促进BMSCs成骨期ALP的活性，为实现局部基因治疗与组织工程的联合应用及构建生物相容性更理想的组织工程骨提供了实验理论依据。

遗传性对称性色素异常症

遗传性对称性色素异常症是一种少见的常染色体显性遗传性皮肤病,皮损以肢端色素异常为主要表现。该病的致病基因已经明确,为DSRAD/ADAR1基因。近年来国内外陆续有新的突变位点报道,但尚未发现突变热点。目前发病机制的研究主要有两种观点:单倍体不足、显性负性作用。

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-DNFGFR1在小鼠BMSCs中的表达及意义

目的探讨含有基因成纤维细胞生长因子受体1显性负性分子(DN FGFR1)的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-DNFGFR1转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后的表达及意义。方法体外分离培养C57/BL小鼠BMSCs,应用综合贴壁的方法纯化BMSCs。由阳离子脂质体介导将pcDNA3.1(+)-DNFGFR1转入BMSCs中,用RT-PCR法检测DNFGFR1mRNA的表达。结果小鼠BMSCs原代培养24h后见细胞贴壁伴有伸展现象,细胞核清晰,10d左右细胞密度明显增加,细胞形成单层,融合率达80%,综合贴壁培养使BMSCs更纯。转染组条带灰度值与β-actin比值(3.8)明显高于未转染组(0.5)。结论 pcDNA3.1(+)-DNFGFR1质粒能被导入BMSCs并得到表达,为研究FGFR1的功能奠定了实验基础。

Wnt信号通路与抗纤维化策略

Wnt信号通路包括经典通路和非经典通路,参与人体各种生理病理过程。Wnt途径的异常与多种纤维增生紊乱性疾病相关,Wnt拮抗剂可以拮抗该途径。Wnt拮抗剂根据作用方式分为sFRP(Secre-ted frizzled related protein)和DKK(Dickkopf)两类家族。另外,显性负性作用以及转化生长因子(TGF)-β等均能调控Wnt信号途径,因此深入研究Wnt信号通路及其调控方式,可为将来抗纤维化治疗提供可行性的途径。

带绿色荧光蛋白标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白的真核表达及其生物学功能研究

目的:构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cdc25c)基因的真核表达载体pEGFP-cdc25c,并检测其在人胚肾293T细胞中的表达定位情况及生物学功能。方法:采用PCR技术从实验室已有质粒中扩增人cdc25c基因,并将其克隆到pEGFP-C1载体中;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测转染细胞的表达情况,荧光显微镜观察cdc25c蛋白在细胞中的定位,并利用cdc2 Tyr15位特异性抗体验证EGFP-cdc25c作为磷酸酯酶的生物学功能。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-cdc25c真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后获得表达,在荧光显微镜下,表达阳性的细胞呈绿色,并定位于细胞质;Western印迹结果表明,EGFP-cdc25c能增加cdc2 Tyr15位的磷酸化水平,起到拮抗内源性cdc25c的功能。结论:构建了带EGFP标签的人cdc25c基因真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞质;EGFP-cdc25c能够发挥显性负性作用,为深入研究cdc25c的生物学功能奠定了重要基础。