利用显性阴性模型对整合素αIIbβ3介导的信号转导的初步研究

本研究目的是明确整合素β3亚单位胞浆段序列在整合素αIIbβ3介导的信号转导中的重要作用,并进一步了解在无αIIb亚单位存在的条件下其对信号转导及特异性的影响程度。运用由IL-2R胞外段和跨膜段(Tac)与整合素β3胞浆段组成的融合蛋白(Tac/β3),使其在表达GPIbIX、整合素αIIbβ3的CHO细胞株(IbIX/IIbIIIa-CHO细胞株)中稳定表达(即得到IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-762细胞),并进行多项试验,包括在固相纤维蛋白原的伸展、稳定黏附试验、细胞纤维蛋白凝块回缩功能试验以及游离纤维蛋白原结合试验(分别代表了外向内及内向外信号转导事件)。结果表明,在稳定表达有Tac/β3的IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-762细胞中αIIbβ3介导的双向信号转导严重受到抑制。结论:Tac/β3可以在IbIX/IIbIIIa-CHO/Tac-762细胞中发挥显著有效的显性阴性作用,并且证实整合素β3亚单位胞浆段的单独存在即可影响由αIIbβ3介导的双向信号转导。

基因重组HBV联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV作用及HBV包装细胞系的构建

目的 探讨HBV作为基因治疗载体的可能性并检验其联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV的作用。方法 在表达完整HBV颗粒的质粒上,经基因修饰后联合表达S区反义RNA和核心-P蛋白的融合蛋白,整合于具有HBV复制的2.2.15细胞,形成细胞克隆,ELISA 法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBV DNA,PCR检测上清液中重组HBV颗粒。HBV全基因经删除包装信号ε区后,插入到G418抗性PCI-neo载体,转染HepG2细胞系,用G418筛选形成细胞克隆,检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系,进一步转染表达复制缺损型HBV的质粒,经两种抗生素同时筛选,PCR方法观察上清液中的病毒。结果 2.2.15-pMEP4组、2.2.15-CP组、2.2.15-SAS组和2.2.15-CPAS组,对HBsAg平均抑制率分别为2.74％±3.83％、40.08％±2.05％（t=35.5,P<0.01）、66.54％±4.45％（t=42.3,P<0.01）和73.68％±5.07％（t=51.9,P<0.01）;对HBeAg平均抑制率分别为4.46％±4.25％、52.86％±1.32％（t=36.2,P<0.01）、26.36％±1.69％（t=22.3,P<0.01）和 59.28％±2.10％（t=39.0,P<0.01）;对 HBV复制的抑制率分别为0、82.0％、59.9％和96.6％。在各治疗组培养上清液中均能检测出重组HBV颗粒。证明包装细胞系具有HBSAg和HBcAg表达。

重组逆转录病毒转导HBV载体表达显性阴性突变体抗HBV作用的研究

目的探讨重组逆转录病毒转导HBV载体表达显性阴性突变体的抗HBV作用。方法在逆转录病毒载体中插入两种不同类型表达显性阴性突变体的HBV基因复制单元,制备重组逆转录病毒pRV-CP、pRV-CS和空载体G1Na对照,并转染HepG2.2.15细胞,ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBV DNA,PCR检测上清液中重组HBV颗粒。结果转染HepG2.2.15细胞后3d、5d、7d、9d和11d,pRV-CP、pRV-CS和G1Na对照组对HBsAg表达的平均抑制率分别为(28.9±4.73)%(P<0.01)、(39.3±7.04)%(P<0.01)和(2.6±3.77)%;对HBeAg表达的平均抑制率分别为(40.38±2.59)%(P<0.01)、(33.1±4.27)%(P<0.01)和(3.1±3.02)%;对HBV复制的抑制率分别为67.2%和55.8%,对照组为13.4%。只有pRV-CP组培养上清液中检测出突变型HBV颗粒。结论重组逆转录病毒能转导HBV载体表达显性阴性突变体,对HBV复制及抗原表达有抑制作用,有望用于抗HBV治疗。

去C末端JAK3基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建去C末端Jak3重组逆转录病毒载体 ,获得能稳定产生去C末端Jak3基因的重组逆转录病毒的细胞株 ,为利用去C 末端Jak3对白血病进行基因治疗的实验研究打基础。方法 :用限制性内切酶从质粒PcJak3(ΔC)中切出目的基因并从凝胶中回收该目的基因片段 ,连接到逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点上构建重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC) ,通过转化感受态细菌后氨卞青霉素筛选、酶切及DNA测序鉴定 ;用脂质体LIPOFECTAMINE转染包装细胞PA317细胞并用G4 18筛选抗性细胞 ,转染的包装细胞包装出病毒粒子 ,同时用PCR方法检测PA317阳性细胞中是否插入目的基因片段 ;用该病毒感染靶细胞NIH3T3,G4 18筛选抗性克隆 ,检测出病毒滴度 ;经免疫沉淀 (IP)、SDS PAGE电泳、Westernblotting检测NIH3T3细胞中Jak3(ΔC)的表达情况。结果 :①重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC)酶切和DNA检序均表明已含有 2 796bp的Jak3(ΔC)基因 ;②转染的PA317阳性细胞经PCR扩增后得到与目的基因一致的片段 ;③病毒滴度为 1.2～ 2 .0× 10 4CFU/ml;④转染的NIH3T3细胞中表达出了Jak3(ΔC)蛋白 ,其分子量为 10 7KD。结论 :我们已成功构建了去C 末端Jak3重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC) ,并得到稳定产生病毒粒子的PA317细胞克隆 ,为利用Jak3(ΔC)

C基因截短突变体抗乙型肝炎病毒作用机制的研究

目的探讨C基因截短突变体抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用机制。 方法 构建C基因截短的真核表达载体pcDNA3—△ C及野生型C基因真核表达载体pcDNA3—C,瞬时转染HepG2细胞,用SDS—PAGE western blot检测pcDNA3—△C、pcDNA3-C的蛋白表达。pcDNA3—△ C与adwR9共转染HepG2细胞,以pcDNA3与adwR9为对照,用荧光定量PCR检测培养上清液及细胞内病毒量,用Native western blot 分析C基因截短蛋白干扰核心颗粒形成。 结果 重组载体pcDNA3—△ C、pcDNA3—C均可表达,pcDNA3-△C与adwR9共转染组上清液和细胞内病毒量较对照组降低,pcDNA3—△ C和pcDNA3—C共转染组Native western blot条带与pcDNA3和pcDNA3—C共转染组条带相比较明显淡。 结论 C基因截短突变体可干扰核心颗粒的形成,导致HBV复制下降。