晚期糖基化白蛋白通过激活caspase-12途径诱导巨噬细胞凋亡

本文旨在研究晚期糖基化白蛋白(advanced glycated albumin,AGE-alb)对巨噬细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)凋亡途径关键分子caspase-12的影响,以阐明AGE-alb对巨噬细胞凋亡的诱导作用及机制。体外培养RAW264.7巨噬细胞,分别给予AGE-alb(2、4和6 g/L)、正常对照白蛋白(control albumin,C-alb,4 g/L)、ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM,4 mg/L)处理,或以ERS抑制剂4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA,5 mmol/L)预处理细胞1 h,然后与AGE-alb(4 g/L)共孵育24 h。采用MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡情况,试剂盒测定培养基乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,免疫印迹法检测caspase-12表达变化。结果显示:与TM相似,AGE-alb显著诱导RAW264.7巨噬细胞损伤,表现为细胞活力降低,LDH漏出和细胞凋亡率明显增加,且呈浓度依赖性。AGE-alb明显上调caspase-12活性,尤其在4和6 g/L浓度时更为显著(P<0.01)。然而,PBA可抑制AGE-alb所致的巨噬细胞活力降低以及LDH漏出和凋亡增加,且减轻AGE-alb诱导的caspase-12活化(P<0.05)。上述结果提示,AGE-alb可诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡,其机制可能与激活caspase-12介导的ERS凋亡途径有关。

活化转录因子6-C/EBP同源蛋白途径介导晚期糖基化白蛋白诱导的巨噬细胞凋亡

本文旨在研究内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)感受器活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)是否介导晚期糖基化白蛋白(advanced glycated albumin,AGE-alb)所诱导的巨噬细胞凋亡,并阐明其可能的分子机制。体外培养RAW264.7巨噬细胞,给予AGE-alb(2、4和6 g/L)处理24 h,以正常白蛋白和ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)处理24 h的巨噬细胞分别作为阴性和阳性对照组,并采用小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)技术沉默ATF6表达。分别采用MTT法和Annexin V-FITC/碘化丙碇双染法检测细胞活力和凋亡情况;试剂盒测定培养基乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和细胞内caspase-3活性;免疫荧光细胞化学法检测ATF6核转位情况;Western blot法检测ATF6和促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)蛋白表达变化,实时荧光定量聚合酶链反应法检测CHOP m RNA表达变化。结果显示:与TM相似,AGE-alb在蛋白和m RNA水平均显著上调ERS凋亡途径关键分子CHOP表达,该作用呈浓度依赖性;Western blot和免疫荧光细胞化学法均显示AGE-alb处理细胞后ATF6明显由胞浆向细胞核内转移;采用si RNA技术沉默ATF6则明显减轻AGE-alb所致的细胞活力降低、LDH漏出、凋亡率增加及caspase-3活化,并可抑制AGE-alb所诱导的CHOP表达上调。上述结果表明,ATF6及其下游分子CHOP介导AGE-alb所诱导的巨噬细胞凋亡。

蛋白激酶C在晚期糖基化终产物促进人腹膜间皮细胞分泌纤维连接蛋白中的作用

目的:观察晚期糖基化终末产物(AGEs)对人腹膜间皮细胞合成和分泌纤维连接蛋白(FN)的影响及细胞内蛋白激酶C(PKC)在其中的作用。方法:在体外制备晚期糖基化人血清白蛋白(AGE-HSA),分别用不同浓度的(0,100,500,1 000μg/ml)AGE-HSA作用于人腹膜间皮细胞,用荧光实时定量PCR和ELISA方法测定人腹膜间皮细胞FN的表达;用ELISA方法观察AGEs对人腹膜间皮细胞PKC活性影响,应用PKC激活和抑制剂观察PKC在AGE-HSA促进人腹膜间皮细胞合成FN中的作用。结果:AGE-HSA呈时间剂量依赖性激活人腹膜间皮细胞中的PKC(P<0.05);AGE-HSA同时以时效和量效方式促进人腹膜间皮细胞中FN基因和蛋白的表达(P<0.05);PKC激活剂佛波酯(PMA)也能刺激人腹膜间皮细胞合成FN,先用PMA耗竭细胞内PKC或用PKC抑制剂calphostin C后,可抑制AGE-HSA诱导的FN分泌(P<0.05)。结论:AGEs可能部分通过活化PKC促进人腹膜间皮细胞合成和分泌FN,参与腹膜纤维化。

晚期糖基化白蛋白通过上调核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3诱导巨噬细胞焦亡

本研究旨在探讨晚期糖基化白蛋白(advanced glycated albumin, AGE-alb)对巨噬细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)-caspase-1途径的影响,以阐明AGE-alb对巨噬细胞焦亡的影响及机制。体外培养RAW264.7巨噬细胞,分别给予AGE-alb (1、2、4和6 g/L)、对照白蛋白(C-alb,4 g/L)处理24h或以NLRP3抑制剂MCC950 (1μmol/L)预处理细胞,1h后以AGE-alb(4g/L)处理24h。MTT法检测细胞活力,试剂盒测定caspase-1和培养基乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性以及白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、IL-18浓度,TUNEL法和Hoechst 33342/PI双染法检测细胞死亡情况,Westernblot分析NLRP3、procaspase-1和cleavedcaspase-1表达变化。结果显示:AGE-alb显著诱导RAW264.7巨噬细胞损伤,表现为细胞活力降低,LDH漏出、TUNEL阳性和PI阳性细胞率显著增加,且呈浓度依赖性,并可促进IL-1β和IL-18分泌。AGE-alb显著上调NLRP3表达和caspase-1活性,尤其在4和6 g/L浓度时更为明显。然而,MCC950预处理可抑制AGE-alb所诱导的RAW264.7巨噬细胞活力降低、LDH漏出、TUNEL阳性和PI阳性细胞率增加以及IL-1β和IL-18分泌,并可抑制AGE-alb所致的caspase-1活化。以上结果表明,AGE-alb可诱导RAW264.7巨噬细胞焦亡,其机制至少部分是通过激活NLRP3-caspase-1信号途径实现的。