人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1的表达及病毒样颗粒的装配

目的 在昆虫细胞中表达人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )哈尔滨地区分离株的晚期蛋白L1,并分离纯化由L1蛋白在细胞中自主组装成的病毒样颗粒 ,为HPV16预防性疫苗的研制奠定基础。方法 获得含有HPV16L1基因的重组杆状病毒并使目的蛋白L1在昆虫细胞中表达 ;对重组杆状病毒的扩增条件及L1蛋白的表达水平进行优化 ;电镜下观察昆虫细胞中晚期蛋白装配成病毒样颗粒的情况 ,经氯化铯密度梯度纯化病毒样颗粒 ,并经Westernblot进行验证。结果 获得了稳定表达L1蛋白的重组杆状病毒 ;以MOI值为 0 .2感染昆虫细胞可获得较高滴度的重组病毒 ,以MOI值为 10感染昆虫细胞可获得较高水平的L1蛋白表达 ;电镜下可观察到昆虫细胞核内直径为 5 5nm的病毒样颗粒 ;病毒样颗粒可通过氯化铯密度梯度离心获得。结论 获得人乳头瘤病毒哈尔滨地区分离株L1蛋白可在昆虫细胞中自主装配的病毒样颗粒并成功分离纯化。

表达HPV18晚期蛋白L1重组毕赤酵母在30L Sartorious生物反应器(C_(30)-3)中的培养与诱导工艺摸索及优化

采用改良后的低盐培养基在30 L Sartorious生物反应器(C30-3)对表达18型人乳头瘤病毒(Human papillom avirus,HPV)晚期蛋白L1重组毕赤酵母进行培养,探讨了在重组毕赤酵母细胞积累阶段和HPV18晚期蛋白L1诱导表达阶段不同的培养基配方、p H值、温度、搅拌转速、溶氧(DO)、重组毕赤酵母细胞积累阶段甘油的补加方式、去除阻碍物甘油的去阻碍时间、重组毕赤酵母表达HPV18晚期蛋白L1阶段诱导剂甲醇的补加方式等工艺参数对表达HPV18晚期蛋白L1重组毕赤酵母的影响。优化后的低盐培养基更适合重组毕赤酵母细胞的生长;重组毕赤酵母细胞积累阶段的培养过程中维持培养液p H值5.0,温度31℃,DO 20%~25%,搅拌转速500 r/min,培养到第20 h开始以恒速补加3 000 m L 40%甘油溶液,培养至重组毕赤酵母细胞湿重≥190 g/L,停止甘油补加,继续培养重组毕赤酵母4 h,消耗阻碍HPV18晚期蛋白L1表达的甘油;之后进入重组毕赤酵母表达HPV18晚期蛋白L1诱导阶段,维持培养液p H值5.2,温度29℃,DO含量45%,搅拌转速600 r/min,控制培养液中甲醇浓度为4%在线补加甲醇,诱导60 h,HPV18晚期蛋白L1的表达量达到了311.43 mg/L。利用30 L Sartorious生物反应器(C30-3)对表达HPV18L1重组毕赤酵母进行培养,经过多次试验建立起了稳定的重组毕赤酵母表达HPV18晚期蛋白L1工艺。

HPV L1 C-末端保守序列短肽体液免疫学特性

目的探讨一段位于HPVL1C-末端、长30个氨基酸残基的保守序列的体液免疫学性质而进行此实验。方法以此序列为基础人工合成短肽,以该短肽免疫小鼠和兔,获得抗血清,通过ELISA,Western Blot及免疫组织化学的方法,分别对含HPV6b,16及18L1的细胞裂解物、重组蛋白或HPV阳性临床标本进行反应。结果抗短肽抗血清能与含HPV6b,16及18L1的细胞裂解物、重组蛋白发生针对HPVL1的反应,能使HPV6和16阳性的临床标本呈现阳性反应,而抗HPV16及抗重组HPV16L1抗血清对此短肽的反应则较弱。结论结果表明由该保守序列短肽诱导的抗血清具有一定的型间交叉反应特征,这一特性可能对研究检测用广谱HPVL1抗体有一定的意义。该序列短肽抗血清对不同型HPVL1反应的差异性及抗血清对多型别HPVL1的反应是否具有中和性,尚需进一步的研究。

原核高效制备人乳头瘤病毒16型L1病毒样颗粒

目的通过原核表达系统高效制备人乳头瘤病毒(HPV)16晚期蛋白L1病毒样颗粒(VLPs)。方法构建HPV16L1基因序列优化前后的PET30aHPV16L1重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3);用IPTG诱导目的基因表达,两步层析方法纯化HPV16L1蛋白;电镜下观察纯化产物形成VLPs的情况。结果成功构建大肠杆菌工程菌,高效可溶表达(目的蛋白约占总蛋白的38%)并纯化HPV16L1蛋白,纯度达95%以上,电镜下观察,发现纯化后的目的蛋白为直径50 nm左右,形态与天然病毒颗粒高度相似。结论在大肠杆菌原核系统中高效、简易地制备了HPV16L1VLPs,为诊断试剂和疫苗的研制奠定基础。