产黑普氏菌刺激原代人口腔角质细胞的时间序列基因表达谱研究

目的基于时间序列分析,研究产黑普氏菌(Prevotella melaninogenica,Pm)刺激原代人口腔角质形成细胞(primary human oral keratinocytes,pHOKs)后基因表达的时间趋势,以探究Pm与pHOKs相互作用的潜在机制。方法利用生物信息学方法分析pHOKs分别与Pm共培养4、24 h后的高通量测序结果,使用Mfuzz聚类算法将具有相似时间表达模式的基因划分聚类,并进行GO、KEGG以及STRING网络分析,进一步利用Cytoscape软件取交集得到枢纽基因(Hub基因)。采用实时荧光定量PCR检测Hub基因的表达。结果Pm刺激pHOKs 4、24 h分别有1456个和1386个差异表达基因。通过Mfuzz将其划分为3个聚类,其中簇1基因随时间延长其表达呈现下降的趋势,主要参与上皮细胞分化和上皮细胞向间充质细胞转化等生物学过程;簇2基因随时间延长其表达呈现上升的趋势,主要参与细菌感染、视黄醇代谢等过程;簇3基因表达在刺激前期上调、后期下调,主要参与细胞因子相关信号通路等过程。在PPI网络中筛选出簇1 Hub基因为VEGFA、GDNF;簇2中的Hub基因为PTGS2、ICAM1等;簇3中的Hub基因为IL-6、CCL2等。RT-qPCR检测结果显示,VEGFA、PTGS2、IFIT1、IRF1与测序数据中随着时间延长基因的表达趋势一致。结论本研究对Pm刺激pHOKs过程中相关生物学分子的动态模式进行了深度挖掘,发现与视黄醇代谢相关的基因以及负调控EMT的基因在OLP中异常表达,Pm入侵上皮细胞后可能通过一些适应性机制逃避免疫监视,该发现有助于进一步探究Pm在口腔扁平苔藓中的致病机理。

慢性根尖周炎感染根管内中间普氏菌基因多态性研究

目的:研究慢性根尖周炎感染根管内中间普氏菌是否存在基因多态性。方法:选择13例慢性根尖周炎患者,分别取其感染根管内样本,分离培养,经中间普氏菌特异引物PCR鉴定的克隆,再利用随机引物PCR(AP-PCR)检测其基因多态性。结果:13例慢性根尖周炎样本中3例分离出中间普氏菌,共95株,并检测出3种基因型,其中A、B、C样本各检出一种基因型。结论:慢性根尖周炎患者感染根管内中间普氏菌存在基因多态性。

中间普氏菌内毒素对人牙周膜细胞增殖的时间效应和细胞周期的影响

目的 :观察中间普氏菌内毒素 (Pi)对离体培养的人牙周膜细胞增殖的时间效应和细胞周期的影响。方法 :采用细胞培养技术、噻唑盐比色测定法 (MTT)和流式细胞仪技术。结果 :MTT法结果表明 ,加入10 μg/mLPi内毒素 3h后 ,即明显抑制人牙周膜细胞的增殖 (P <0 .0 5 ) ,且抑制作用随时间的延长而增强。流式细胞仪结果表明 ,在 10 μg/mLPi内毒素作用后 6和 12h ,DNA合成前期细胞所占百分比 (G1% )有所增高 ,而DNA合成期细胞所占百分比 (S % )降低。作用 2 4h后S期细胞数量增加 ,G1期细胞数量下降。结论 :Pi内毒素对人PDLC有直接毒害作用 ,可能是内毒素抑制静止态的G1期细胞进入S期 ,从而抑制细胞的增殖。

中间普氏菌和脆弱类杆菌内毒素对人牙周膜细胞增殖和超微结构的影响

目的 :观察中间普氏菌和脆弱类杆菌的内毒素对人牙周膜细胞增殖和超微结构的影响。方法 :体外培养人牙周膜细胞 ,MTT法测定中间普氏菌和脆弱类杆菌的内毒素对人牙周膜细胞增殖的影响 ,找出显效浓度 ,并应用透射电镜技术观察该浓度下两种内毒素对人牙周膜细胞超微结构的影响。结果 :两种内毒素在 10 μg/mL浓度时即能显著抑制人牙周膜细胞的增殖 ,该抑制作用随内毒素浓度增高而增大。 10 μg/mL浓度的内毒素使人牙周膜细胞的线粒体、内质网、高尔基氏体肿胀 ,溶酶体增多 ,核质浓集 ;甚至造成部分细胞死亡。结论 :中间普氏菌和脆弱类杆菌的内毒素可对人牙周膜细胞产生毒害作用 ,二者之间无明显差异。

抗中间普氏菌卵黄抗体的制备及其对实验性妊娠期龈炎的预防作用

目的制备并纯化抗中间普氏菌卵黄抗体(抗P.intermedia-IgY),观察其对大鼠实验性妊娠期龈炎的预防作用。方法厌氧培养P.intermedia菌,2%甲醛灭活,以终浓度为1×109CFU/ml的P.intermedia菌,1 ml(0.5 ml菌液+0.5 ml佐剂)/次,免疫蛋鸡4次。用卵黄分离器去除蛋清,无菌注射器刺破卵黄膜,收集卵黄液,两步硫铵沉淀法纯化抗P.intermedia-IgY。SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot、ELISA对其分子量及特异性鉴定,并检测免疫后效价变化。将30只雌性SD大鼠,15只雄性SD大鼠,雌∶雄=2∶1,合笼获得24只孕鼠,随机分为4组:0.12%氯己定孵育组,抗P.intermedia-IgY孵育组,生理盐水孵育组,空白对照组,观察抗P.intermedia-IgY对实验性妊娠期龈炎的抑制作用。结果经4次免疫后抗体最高效价为1∶512 000,维持45 d。1 g卵黄经两步硫铵沉淀后得IgY约18 mg。SDS-PAGE凝胶电泳显示纯化后IgY纯度达64.5%。Western blot显示抗P.intermedia-IgY识别并特异性结合P.intermedia菌裂解片段。动物实验观察见0.12%氯己定孵育组及抗P.intermedia-IgY孵育组牙龈指数显著低于生理盐水孵育组(P<0.01),而两者之间牙龈指数差异无统计学意义。牙龈组织病理学观察显示抗P.intermedia-IgY孵育组牙龈的炎症状态轻于生理盐水孵育组。结论经4次免疫后可得到持续高效价的抗P.intermedia-IgY,且抗P.intermedia-IgY能够减轻大鼠实验性妊娠期龈炎的炎症状态,对大鼠实验性妊娠期龈炎有一定的预防作用。

血链球菌胞内蛋白与胞外蛋白对中间普氏菌与牙龈卟啉单胞菌生物膜作用的研究

目的:提取血链球菌胞内蛋白与胞外蛋白,研究两者对中间普氏菌(P.i)与牙龈卟啉单胞菌(P.g)生物膜的作用。方法:通过低温超速离心,有机溶剂萃取法提取血链球菌胞外蛋白;通过超声破碎,硫酸铵盐析,SephadexG-25除盐及透析的方法提取血链球菌胞内蛋白。观察血链球菌胞内蛋白与胞外蛋白对P.i及P.g的作用。观察血链球菌胞内蛋白与胞外蛋白对P.i及P.g混合培养形成的生物膜作用。结果:血链球菌胞内蛋白对混合培养的P.i与P.g的生长有明显抑制作用,其最小抑菌浓度为0.125g/L;血链球菌胞外蛋白对P.i与P.g未见抑菌作用。P.i与P.g混合培养形成的生物膜在血链球菌胞内蛋白作用后,生物膜活性降低,与对照组相比具有显著差异(P<0.05);但在血链球菌胞外蛋白作用后,生物膜活性与对照组相比差异不具有统计学意义。结论:血链球菌胞内蛋白对P.i和P.g及两者混合培养形成的生物膜具有明显抑制作用;而血链球菌胞外蛋白对P.i和P.g及两者混合培养形成的生物膜无抑制作用。

牙龈卟啉菌、中间普氏菌的分离、培养和鉴定

目的 :采用厌氧培养和鉴定技术 ,分离牙周炎患者龈下菌斑中的牙龈卟啉菌和中间普氏菌。方法 :采集牙周炎患者的龈下菌斑 ,厌氧培养 ,分离产黑色素菌。经长波长紫外灯观察、各种生化分析和间接免疫荧光染色 ,分离和鉴定牙龈卟啉菌、中间普氏菌。结果 :在受检的 33例牙周炎患者中 ,2 4例患者检出了牙龈卟啉菌 ,总检出率为 72 .72 % ,共分离了 79株。 18例患者检出了中间普氏菌 ,总检出率为 5 4 .5 4 % ,共分离了32株。结论 :厌氧培养、生化反应鉴定技术的发展 ,使牙龈卟啉菌和中间普氏菌的分离与培养准确可靠 。

脂酶试验与聚合酶链反应鉴别中间普氏菌的比较研究

目的 研究脂酶试验和常规生化方法与聚合酶链反应比较在鉴别中间普氏菌 Pi中的敏感度和特异度。方法 对 2 0 7株牙周临床分离的产黑色素 G-厌氧杆菌分别进行脂酶试验、常规生化法鉴定和16 sr RNA特异引物 PCR鉴定。结果 2 0 7株实验菌中 PCR鉴定出 Pi97株 ,脂酶试验检测出 Pi12 6株 ,其中有 85株 PCR阳性 ,其敏感度为 87.6 % ,特异度为 6 3.7%。常规生化方法和脂酶试验共同鉴定出 Pi 80株 ,其中有 6 5株 PCR为阳性 ,其敏感度为 6 7% ,特异度为 86 .4%。结论 脂酶与常规生化方法对 Pi的鉴别能力低于 PCR(P<0 .0 5 ) ,尚不能作为

中间普氏菌内毒素脂多糖的细胞免疫介导活性

采用酚水法提取中间普氏菌ＡＴＣＣ２５２６１内毒素脂多糖，通过Ｋｒａｍｅｒ测定法，软琼脂细胞培养法、胸腺细胞增殖法以及局部斯氏反应测定脂多糖的免疫细胞生物学活性。结果显示，纯化脂多糖可显著地诱导小鼠模型生成肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）、集落刺激因子（ＣＳＦ）和白介素－１（ＩＬ－１），并在一定范围内呈剂量依赖型。同时中间普氏菌内毒素还可刺激皮肤形成典型的局部斯氏反应。

中间普氏菌在家庭成员牙周菌斑中的分布调查

目的 :调查了解中间普氏菌在牙周健康人群中的分布状况。方法 :收集符合纳入标准的 6 0个家庭、181例受试者的牙周颈缘龈上菌斑和龈沟内的龈下菌斑 ,采用厌氧菌培养技术获得 2 79株产黑色素的G- 厌氧杆菌 ,然后进行产黑色素的G- 厌氧杆菌的纯化培养及微量生化鉴定。结果 :中间普氏菌在牙周较健康的父母和儿童牙周菌斑中均可检出 ,儿童群体中中间普氏菌阳性率达 70 49% ,而成人群体中中间普氏菌阳性率为 43 33% ,二者有显著性差异 (P <0 0 1)。结论 :中间普氏菌可能是易在牙周较早定植的固有组成细菌 ,属条件致病菌。该菌在牙周疾病进程中的确切作用尚需对受试者进行长期的追踪研究。

中间普氏菌内毒素刺激人牙周膜细胞上调表达基因的研究

目的 :用基因芯片研究中间普氏菌内毒素刺激前后 ,牙周膜细胞上调表达基因。方法 :应用点样数 5 12点的基因芯片分析中间普氏菌内毒素刺激人牙周膜细胞上调表达基因。结果 :研究发现中间普氏菌内毒素刺激牙周膜细胞后有 6条上调基因 ,其中部分基因与蛋白激酶和蛋白磷酸酶有关。结论 :牙周致病菌内毒素刺激牙周膜细胞后 ,可引起部分基因表达上调 ,从而影响牙周膜细胞正常的生理功能。

冠心病人口腔龈下菌斑中血链球菌、中间普氏菌的比较研究

目的:探讨口腔龈下菌斑中血链球菌、中间普氏菌与冠心病的关系。方法:检查与记录60例研究对象(冠心病组与对照组各30例)的牙龈指数(GI)、菌斑指数(PLI)、牙周袋探诊深度(PD)。应用生化法检测两组研究对象龈下菌斑中的血链球菌数,并用定性随机引物酶链反应法对两组研究对象龈下菌斑中的中间普氏菌进行了鉴定。结果:冠心病组的PD、PLI和龈下菌斑中的血链球菌数及中间普氏菌检出率明显高于对照组(P(0.05)。结论:冠心病组的牙周健康状况相对更差,与冠心病有关的口腔细菌除血链球菌外,龈下菌斑中的中间普氏菌也与冠心病的发病关系密切。

中间普氏菌与其它几种口腔细菌相互作用的动态观察

运用细菌混合培养实验，通过菌落计数、离子色谱分析、电子探针及扫描电镜技术显示了中间普氏菌与血链球菌、变形链球菌呈拮抗关系；与具核梭杆菌、伴放线放线杆菌呈共生关系。血链球菌对中间普氏菌的拮抗可能与改变细胞膜离子浓度，从而抑制了中间普氏菌生长及代谢有关。本研究提示血链球菌在牙周微生态环境中起重要作用。

黑色普氏菌对人血红蛋白的利用和结合

目的 :观察黑色普氏菌能否利用人血红蛋白作为其铁源并与其结合。方法 :将黑色普氏菌接种于含有各种浓度血红蛋白的TSB -联吡啶培养基中 ,厌氧培养 ,分光光度计监测细菌生长。采用斑点印迹法观察黑色普氏菌能否与人血红蛋白结合。结果 :人血红蛋白能够浓度依赖性地促进黑色普氏菌的生长 ,黑色普氏菌能够与人血红蛋白结合 ,其结合强度受pH影响 ,pH =5时结合能力最强。结论 :黑色普氏菌能够有效地利用人血红蛋白作为其铁源并与其结合。

中间普氏菌在慢性牙周炎发病中的作用

对中间普氏菌在慢性牙周炎发病中的作用机制进行了综述。中间普氏菌通过向牙周组织黏附和定植、直接侵袭口腔组织细胞、促进炎性细胞因子的释放、干扰宿主免疫反应、促进骨吸收、抑制骨形成等作用而参与牙周炎的发生发展。

中间普氏菌培养上清对牙龈成纤维细胞RANKL/OPG表达的影响

目的:探讨中间普氏菌培养上清对牙龈成纤维细胞核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的影响。方法:将系列浓度的中间普氏菌培养上清作用于牙龈成纤维细胞,显微镜下观察细胞的变化。实时定量RT-PCR法和Western blot法分别检测RANKL、OPG mRNA及蛋白水平的表达,并计算RANKL/OPG的比值。结果:牙龈成纤维细胞的数量随中间普氏菌培养上清浓度的增加而减少,50μg/mL时,显微镜下没有活细胞存在。在mRNA水平上和蛋白水平上,RANKL/OPG的比值在12.5μg/mL处理组均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:中间普氏菌培养上清可诱导人牙龈成纤维细胞表达RANKL和OPG,破坏RANKL/OPG比例的平衡,影响破骨细胞分化的细胞因子微环境,在破骨细胞分化和牙周炎骨吸收中起着一定的调节作用。

种植体周围袋中中间普氏菌的检测及临床意义

目的:研究一年内人工种植牙龈下中间普氏菌的变化情况,为种植体的定期维护提供理论基础。方法:临床选取38名种植患者的46枚种植体,并将其分成A、B两组。A组是种植修复后1年时探诊种植牙周有出血的种植体20枚,B组是无探诊出血的种植体26枚。检查记录种植修复后1个月,修复后3个月,修复后6个月,修复后12个月四个时段,入选种植牙的菌斑指数(PL)I,牙龈指数(G)I,探诊深度(PD),X-线骨吸收值;采用中间普氏菌的选择性培养基对种植体龈下菌斑标本进行了分离培养。结果:横向比较A、B两组之间中间普氏菌计数、牙龈指数(G)I、探诊深度(PD)有统计学差异,其余检测指标无统计学差别。修复后3月时,A、B两组之间中间普氏菌计数值有统计学差异。纵向比较,随时间延长,A、B两组种植牙周中间普氏菌检出量不断增加,1月到3月时增加的趋势最为明显,到6个月左右趋于稳定。其统计值在1个月和3个月比较有统计学差异,但在6个月和12个月比较无统计学差异。各临床指标和X-线指标随时间的变化无统计学意义。结论:在临床工作中,应注意加强修复后3月时种植患者的口腔维护,防止种植体周围炎的发生,提高种植成功率。

中间普氏菌内毒素刺激前后下调人牙周膜细胞表达基因的研究

目的 :研究中间普氏菌内毒素刺激前后牙周膜细胞下调表达基因。方法 :应用点样数 5 12点的基因芯片分析中间普氏菌内毒素刺激前后牙周膜细胞下调表达基因。结果 :研究发现中间普氏菌内毒素刺激牙周膜细胞后 8条下调基因 ,包括转录调控基因、凋亡相关基因和受体基因。结论 :中间普氏菌内毒素刺激牙周膜细胞后 ,可引起部分基因表达下调 。

中间普氏菌菌体蛋白抗原研究

中间普氏菌菌体蛋白抗原研究华西医科大学口腔医学院口腔内科（６１００４１）潘亚萍，张蕴惠，肖卓然 华西医科大学口腔医学院中心实验室章锦才，张萍，肖晓蓉中间普氏菌（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）原称中间类杆菌（Ｂａｃｔｅｒｏ...

黑色普氏菌与血红蛋白结合的特点及其血红蛋白结合蛋白的鉴定

目的 :观察黑色普氏菌与血红蛋白结合的特点并鉴定血红蛋白结合蛋白。方法 :采用斑点印迹法观察黑色普氏菌的血红蛋白结合特点 ,利用SDS -PAGE及Westernblot法鉴定血红蛋白结合蛋白。结果 :热及胰蛋白酶预处理细菌使血红蛋白结合能力分别降低 6 8%和 35 % ,珠蛋白的抑制率为 81% ,乳铁蛋白部分抑制血红蛋白结合 ,转铁蛋白、细胞色素C和过氧化物酶对血红蛋白的结合皆无抑制作用。Westernblot结果显示 ,相对分子量Mr为 4.1× 10 4 ,5 .6× 10 4 和 5 .9× 10 4 的膜蛋白能与血红蛋白反应。结论 :4.1× 10 4 ,5 .6×10 4 和 5 .9× 10 4 的细胞膜蛋白可能参与了黑色普氏菌与血红蛋白的结合。