普通油茶良种资源表型性状多样性分析与综合评价

普通油茶(Camellia oleifera)是我国总产油量最高、栽培面积最广的木本油料作物。为促进我国普通油茶良种资源的挖掘与利用,本研究使用主成分分析、相关性分析、聚类分析、巢式方差分析、多元回归分析等方法以及变异系数、表型分化系数、香农-维纳多样性指数,探究560份普通油茶良种资源的表型性状多样性及其与环境因子的相关性,并使用熵权TOPSIS法对560份普通油茶良种资源进行综合评价和排序。结果表明,560份普通油茶良种资源存在丰富的遗传多样性,34个表型性状的香农-维纳多样性指数为0.05~2.35,均值为1.06,数量性状的变异系数为3.02%~53.33%,均值为23.25%。普通油茶良种资源34个表型性状种源间和种源内的方差分量均值分别为53.591%和32.382%,说明普通油茶良种资源表型性状种源内相似性较高,其分化主要来自种源间。随着纬度的升高和年平均温度的降低,普通油茶良种资源平均单果质量、种仁含油率及饱和脂肪酸含量呈现下降趋势,而不饱和脂肪酸含量呈现上升趋势,表明纬度和年平均温度是限制普通油茶生长的主要因子。熵权TOPSIS法综合评价和排序结果显示,长林4号综合得分指数最高,浙江、云南、安徽、湖南等地区均有多个选育的良种综合排名在前30以内。本研究结果为普通油茶育种及良种推广提供了数据支撑。

冷胁迫下普通油茶CCCH型锌指蛋白基因家族的鉴定和分析

【目的】为挖掘和利用耐寒普通油茶Camellia oleifera遗传资源提供参考。【方法】基于普通油茶的冷胁迫转录组数据,对其CCCH型锌指蛋白基因进行鉴定,并对CCCH型锌指蛋白进行理化性质分析、系统发育分析、保守结构域预测、二级结构预测等相关生物信息学分析,并以庐山高海拔油茶(LSG)和栽培油茶品种赣无1(GW1)为材料,对CCCH型锌指蛋白基因在冷胁迫下的表达情况进行分析。【结果】在普通油茶的冷胁迫转录组数据中共鉴定到24个CCCH型锌指蛋白基因,参考水稻分类方法,将24个CCCH型锌指蛋白聚类到2个亚家族中。保守基序分析结果表明,在24个基因中仅有3种CCCH型锌指蛋白基序类型,即C-X8-C-X5-C-X3-H、C-X7-C-X5-C-X3-H和C-X5-C-X4-C-X3-H,数目分别为92、4和4。转录组表达谱分析结果表明:在野外冷胁迫试验中CoC3H17基因在D4、D5和D6时期的表达量高于D1、D2和D3时期,在室内冷胁迫试验中庐山高海拔油茶和赣无1的CoC3H17基因一直表现为更高的转录本丰度;CoC3H14和CoC3H24基因在野外试验的D4、D5和D6时期均表现为表达量明显上升,且在室内冷胁迫试验中庐山高海拔油茶的这2个基因的表达量高于赣无1。【结论】CoC3H17、CoC3H14和CoC3H24基因可能是普通油茶应对冷胁迫的关键基因。

中国主要油茶产区山茶炭疽菌群体遗传结构分析

以中国主要油茶产区的油茶(Camellia oleifera Abel.)炭疽病优势种山茶炭疽菌(Colletotrichum camelliae)的16个地理种群168个菌株为供试材料,应用ISSR分子标记技术进行遗传多样性和种群遗传结构分析。16个地理种群的多态位点百分比(PPB)为98.99%,Nei’s基因多样性指数(He)为0.28,Shannon信息多样性指数(Is)为0.43,遗传相似度(I)平均为0.834,遗传距离(D)平均为0.183,表明山茶炭疽菌遗传多样性水平较高且异质性较强,种群间存在一定程度的遗传变异,遗传距离与地理距离之间无相关性。湖北省、浙江省、江西省、湖南省和广西5个省级种群总基因多样度(Ht)为0.274 8,遗传分化系数(Gst)为0.517 4,基因流(Nm)为0.466 4,表明山茶炭疽菌5个省级种群虽然被分化,但是不存在基因流动现象(Nm<1)。

普通油茶与小果油茶的叶绿体基因分子鉴定标记

[目的]开发能够准确、便捷、快速鉴定普通油茶与小果油茶的叶绿体基因分子标记,为油茶遗传资源的挖掘与利用提供参考。[方法]基于高通量测序技术组装了普通油茶和小果油茶的叶绿体全基因组,通过比较基因组学技术寻找两者叶绿体全基因组的差异,并根据其差异来开发可用于鉴定普通油茶与小果油茶的分子标记。为验证标记的有效性,分别选取具有代表性的12个普通油茶居群和6个小果油茶居群的个体,提取叶绿体全基因组,进行PCR扩增和凝胶电泳检验。[结果]组装的普通油茶与小果油茶叶绿体基因组序列全长分别为156 977、156 539 bp,两者叶绿体全基因组具有高度的保守性,但小果油茶在atpH基因与atpI基因间的非编码区存在长度为452 bp的大片段缺失。所开发引物的PCR扩增结果表明,所有普通油茶样本均可扩增出609 bp的条带,而小果油茶扩增出227 bp的条带,条带差异显著且稳定。[结论]使用所开发的分子标记能够稳定、便捷、精确地鉴定出普通油茶与小果油茶,但是使用时应先确定所鉴定的物种为普通油茶和小果油茶中的一种。

油茶巢式交配子代油脂相关性状的遗传分析

【目的】探究油茶种内杂交和种间杂交的亲本选配机制,为油茶高含油率杂交育种选育提供指导。【方法】以油茶巢式交配设计的种内、种间杂交子代为材料,分别测定种仁含油率、木质素、纤维素和半纤维素含量,分析母本的一般配合力(GCA)、杂交组合的特殊配合力(SCA),解析重要性状的遗传效应。【结果】12个家系的种仁含油率为17.83%~53.55%,木质素含量为4.68%~18.12%,纤维素含量为3.66%~13.04%,半纤维素含量0.54%~12.20%。种仁含油率、木质素、纤维素和半纤维素含量的差异在组合间和母本内父本间达到了显著水平。含油率和木质素、半纤维素含量呈显著负相关关系,其相关系数为-0.489和-0.297。长林4号种仁含油率的GCA最高,达到1.57。各组合的SCA分析表明,含油率SCA为-6.38~4.28,其中含油率SCA高且其余3个性状SCA低的种内杂交组合有40×95和4×18。种间杂交组合含油率的SCA普遍较低,仅53×小2较高,为2.77。除木质素外,含油率、纤维素、半纤维素含量主要受显性效应控制,非加性方差大于加性方差,说明以这3个性状为目标的杂交育种中评估亲本的SCA比GCA更重要。4个性状的单株遗传力范围为10.84%~58.35%,家系遗传力为4.23%~.21.35%,均受到较强的环境效应影响。【结论】以配合力为参考指标,结合各组合的表型数据,选出可用于油茶高含油杂交种质创制的优良种内杂交组合40×95和4×18,种间杂交组合53×小2。

广西普通油茶果及林地土壤持久性有机污染物分布特征

为确定广西普通油茶(Camellia oleifera)中持久性有机污染物的分布特征,以广西主要普通油茶产区48个采样点的48批普通油茶果及林地土壤为研究对象,采用GC-MS/MS分析16种多环芳烃(PAHs)、17种多氯联苯(PCBs)、23种有机氯(OCPs)和18种邻苯二甲酸酯(PAEs)的污染水平。结果表明,林地土壤及普通油茶种皮、壳和籽仁中主要PAHs有10种;PCBs污染程度均较低;主要PAEs为DIBP、DBP和DCHP;林地土壤主要OCPs为γ-六六六(林丹)、七氯、异狄氏醛和硫丹硫酸盐,普通油茶种皮、壳和籽仁主要OCPs均为p,p′-DDT、七氯、异狄氏酮和γ-六六六(林丹)。PAHs、PCBs在林地土壤中的总含量高于普通油茶种皮、壳和籽仁,但未影响普通油茶果的食用安全;可采用杜绝有机物燃烧、增加炭基肥的施用量降低PAHs、PCBs对土壤的影响。减少农药、化肥的使用,降低OCPs污染。对PAEs的污染情况进行进一步监控。

普通油茶种子4个发育时期的转录组分析

我国油茶产业迅速发展,种苗繁育及栽培技术不断进步,但油茶分子基础研究薄弱,决定油茶产量、茶油质量、抗性等指标的重要经济、生长性状的分子机理研究甚少,这必将阻碍油茶产业的可持续发展。本项目首次采用高通量测序技术solexa技术对普通油茶"长林4号"无性系种子发育的4个时期转录组进行测序,经组装分析获得80 310条unigene,其中确定编码蛋白功能的有21 789条,分为24大类,占All-unigene的27.13%。通过与KEGG库比对,对42 638个unigene进行了Pathway注释,涉及的pathway有265个,主要包括新陈代谢、遗传信息加工、细胞代谢等相关pathway。这些相关研究为分析基因表达的数量及调控模式,分析基因表达调控元件的变化规律,揭示不同发育期基因表达差异等研究打下了良好基础,将为定向育种提供有力的理论指导和技术支持。

普通油茶叶绿体基因组密码子偏好性分析

为了利用叶绿体基因工程技术改良普通油茶的重要经济性状,该研究以普通油茶叶绿体全基因组序列为材料,从中筛选出51条长度大于300 bp且以ATG起始的非重复CDS(Coding DNA Sequence)为对象,利用CodonW软件分析其密码子偏好性。结果表明:密码子第三位GC含量为27.55%,ENC范围在35.23~56.67之间,平均值为46.09;RSCU值大于1.00的密码子数目为30个,其中29个第三位碱基以U或A结尾;中性绘图表明GC12与GC3的相关系数为0.143,相关性不显著,回归系数为0.0573;频数分布显示,55%基因的ENC比值集中分布在0~0.1,25%基因的ENC比值分布在0.1~0.2之间;对应分析结果表明,第一向量轴占10.12%的差异,第二向量轴占9.36%的差异,其余两轴分别占7.97%和7.46%,前4轴累计差异为34.91%。中性绘图、ENC-plot和对应性分析均表明普通油茶叶绿体基因密码子偏好受突变作用,更多受选择的影响。最终取高表达优越密码子和高频密码子共有的CUU、AUU、GUU、GUA、UAA、CAA、AAA、GAC、GAA、CCU、ACU、GCU、GCA、UGU、CGU、AGU、UUG、GGU等18个密码子作为最优密码子。该研究结果为利用叶绿体基因工程技术改良普通油茶重要经济性状奠定了基础。

普通油茶无性系花粉离体萌发特性

以6个普通油茶无性系花粉为试验材料,采用正交试验研究了不同温度、硼元素用量、蔗糖浓度、琼脂用量对花粉萌发的影响,以揭示普通油茶花粉在离体条件下的萌发特性。结果表明:4个影响花粉萌发率的试验因素中,温度是极显著影响因素,以25℃最优;蔗糖浓度也能显著影响多数无性系,以10%最优;硼元素用量和琼脂用量仅对个别无性系有显著影响,分别以100 mg·kg-1和0.5%最优。结合多重比较,处理T9为试验优选组合;花粉管的生长从开始到停止略呈"慢—快—慢"的抛物线趋势;稍高的钙离子浓度显著抑制花粉萌发,低浓度锌、钼离子对花粉萌发略有促进,高浓度则效应为负。

普通油茶花粉形态及花粉管活体萌发的研究

利用扫描电子显微镜观察了3个普通油茶优良品系的花粉形态,并利用荧光显微镜观察普通油茶杂交授粉后不同时间段花粉管的生长状况,以探讨普通油茶在山茶科中系统发育的地位以及花粉管在授粉后的动态发育过程。结果表明,普通油茶花粉形态一般为椭球或近球形,大小中等,具三沟,外壁纹饰为脑纹或桔皮状,符合山茶属花粉的种属特征,在山茶科系统发育中为较原始的类群;杂交授粉后0.5h,花粉管开始萌发,8h花粉管生长端可达花柱中部,24h穿过花柱基部进入子房,约48h即可完成受精过程;花粉萌发试验表明活体授粉的花粉萌发及生长量显著高于离体培养花粉。

普通油茶无性系岑软3号嫁接亲和性研究

以普通油茶本砧嫁接为对照,研究博白大果油茶、广宁红花油茶、香花油茶、陆川油茶与普通油茶优良无性系岑软3号苗期的嫁接亲和性。结果表明:香花油茶作为砧木嫁接岑软3号的成活率及存活率分别达到了91.67%和98.55%,抽梢以及嫁接苗的生长与以普通油茶作为砧木均没有显著性差异,参试的4个物种中香花油茶与岑软3号的嫁接亲和力最好;其次是陆川油茶,嫁接成活率和存活率分别达到了93.67%和95.00%,但嫁接苗生长1年后叶片N、P、K含量显著低于对照;广宁红花油茶在嫁接过程中表现出了一定的不亲和性,嫁接成活率仅为72.00%,且后期生长受到抑制;而博白大果油茶嫁接成活1 a后的存活率仅为24.49%,生长受阻,嫁接后期表现出了明显的不亲和性。

普通油茶砧穗嫁接组合的亲和性分析

利用普通油茶长林系列3、4、18、22、23、26、27、40、53号的穗条和砧木种子开展油茶砧穗嫁接研究。结果发现,油茶幼苗的生长受到砧穗互作的影响,本砧嫁接存活率高,达到94%;在长林3、4、18、22、23、27、40、53号作为砧木时,除53号外,其它品种砧木有助于长林3号的生长;长林3号作为砧木时,根系生长受到接穗影响,弱于本砧嫁接。

普通油茶不同嫁接组合对苗木根系生长发育的影响

对普通油茶长林系列长林3号、长林4号、长林18号、长林23号、长林27号、40号、长林53号、长林166号的穗条和普通油茶砧木开展嫁接苗根系研究。结果表明,不同品种的接穗对油茶嫁接苗根系有很大的影响。不同品种的普通油茶接穗嫁接2年后,苗木在根系体积、根系表面积、根系长度及根系生物量等指标上均表现显著差异,根系总长为1718.04 cm,为最小的3倍;根系表面积最大为498.27 cm^2,为最小的3.1倍;根系体积最大为12.16 cm^3根系长度最长,为最小的3.2倍。除个别例外,所测量指标两两之间均成极显著相关。在不同根级之间,在0.0<d≤0.5 mm根级根系长度最长,但根系表面积和根系体积最小,在d>2.0 mm根级根系长度最短,根系表面积和根系体积反而最大。

普通油茶体胚再生体系研究

为构建农杆菌介导的油茶遗传转化受体系统,选择普通油茶‘长林’4号、53号和166号的幼胚为外植体材料,进行多因素多水平的组织培养试验。结果表明:培养基的p H对愈伤组织诱导率影响不显著,愈伤组织的诱导率受油茶品种影响极显著;‘长林’53号的幼胚极易实现胚性愈伤组织诱导和完整植株再生,MS培养基是最佳培养基,2,4-D和TDZ为幼胚较敏感的植物激素,对愈伤组织诱导影响最大;当MS+2 mg/L 2,4-D+0.5mg/L TDZ处理时,‘长林’53号体胚诱导率为98%;MS+1 mg/L 2,4-D+2 mg/L KT+500 mg/L CH处理时,‘长林’53号体胚诱导率为89.6%。在不同2,4-D、KT、TDZ和添加物水平的L9(34)正交试验中,除3个处理外,其他处理组合的‘长林’53号体胚诱导率都达到100%。已分化的胚性愈伤组织在不含任何激素的MS培养基上,可以实现胚状体的萌发、生长及完整植株再生。

普通油茶和小果油茶木材构造与物理性质的研究

油茶树除常规油茶果产出外,综合利用油茶木材,可有效减少资源浪费,同时弥补木材资源的不足。以小果油茶和普通油茶木材为对象,对其物理性质和构造特征等进行研究。结果表明,木材气干密度普通油茶为0.81 g·cm^-3,小果油茶为0.85 g·cm^-3;木纤维长度、宽度、双壁厚指标普通油茶为1801、25、10.8μm,小果油茶为1530、25、10.2μm;导管长度、宽度、双壁厚指标普通油茶为715、61、16μm,小果油茶为759、63.8、15.8μm;木材的导管、木纤维、木射线构造的组织比量普通油茶为15%、69%、14%,小果油茶为11%、72%、15%;普通油茶木材微纤丝角为13.4°,小果油茶为12.6°;木材结晶度普通油茶为63%,小果油茶为64%。综合结果表明,小果油茶和普通油茶木材构造和物理性质具有一定的相似性,两者具有亲缘关系,但在解剖结构上又具有一定的差异性,可区分2种木材;2种木材的气干密度均达到《木材主要物理力学性质分级表》规定Ⅳ级,具有较好的理论密度,木材有较高纤维结晶度和较小的微纤丝角,其主干部分可用于实木加工利用;木材纤维形态特征和组织比量均达到木材纤维制品标准要求,其枝丫材和加工剩余物可用于造纸或纤维板生产,以充分利用资源。

普通油茶泛素结合酶UBE2-J2的cDNA序列及蛋白质结构分析

泛素结合酶(E2)是泛素/26S蛋白酶体途径中3个关键酶之一,在靶蛋白识别、与泛素连接酶(E3)互作等蛋白的泛素依赖性水解和N-末端规则依赖性水解途径的关键环节中起重要作用。采用Solexa测序技术获得了1条普通油茶E2的全长cDNA序列,命名为UBE2-J2,该基因编码239AA,与其它物种的E2具有较高的一致性和相似性;同源建模的结果表明:普通油茶UBE2-J2蛋白具有泛素结合酶催化位点(UBCc),第8 122位氨基酸碱基为其泛素结合酶基因家族的保守区域,第75 122位氨基酸残基区域中有17个可与泛素形成硫酯键中间产物的残基,其中,87位的半胱氨酸残基是该酶活性中心位点,另有5个残基是与E3酶相互作用的位点。UBE2-J2具有C端延伸结构,故普通油茶UBE2-J2蛋白属于II类E2基因家族成员。

广西普通油茶种质资源遗传多样性的SSR分析

普通油茶（Camellia oleifera）是我国分布最广、产量最多的山茶属中一个重要油料树种。广西是普通油茶的重要分布区,种质资源十分丰富。为深入了解广西普通油茶种质资源的遗传变异,服务于种质保存和品种选育,该研究首先对已开发的SSR分子标记进行多态性筛选和评价,在此基础上利用多态性较高的引物,对97份广西有代表性的普通油茶种质资源进行遗传多样性分析。结果表明：（1）在已开发的10对油茶SSR分子标记中,7对能稳定扩增且表现为共显性,2对扩增不稳定,另外1对无法扩增出产物。（2）7对共显性SSR标记总共检测到33个等位基因,每对标记检测到等位基因数目的变化范围为3-6个,平均每个位点等位基因数为4.714 3个,有效等位基因数目的变化范围为2.084 2-4.314 8,平均有效等位基因数为2.828 8;基因多样性变化范围为0.520 2-0.768 2,平均每个位点基因多样性为0.628 1。（3）参试群体中绝大多数位点未处于Hardy-Weinberg平衡,存在遗传结构;观测杂合度和期望杂合度的变化范围分别为0.413 0-0.670 1和0.523 3-0.772 4,其平均值分别为0.569 8和0.631 6。（4）种质资源间遗传距离变化范围为0.05-0.791 7,平均遗传距离为0.354 5;UPGMA聚类显示相同来源的种质资源无法聚成一类,在同一聚类分支上混有不同来源的种质资源。这表明已开发的油茶SSR分子标记适用于广西普通油茶,广西普通油茶种质资源拥有较丰富的遗传多样性。该研究结果为广西普通油茶资源的深度开发和高效利用提供了科学依据。

普通油茶杂交子代幼林经济性状的遗传分析

为了建立油茶杂交育种最佳亲本选配模式,提高育种效率,以浙江省金华市东方红林场6个普通油茶杂交组合子代林为试材,分析了亲本在杂交子代单株产果量、果实大小、出籽率、干籽出仁率、种仁含油率、脂肪酸成分含量等17个经济性状的一般配合力(GCA)和特殊配合力(SCA),估算了各性状的遗传参数。结果表明,除了鲜果干籽率外,其余16个经济性状在6个杂交组合间均存在显著差异;亲本在各性状的一般配合力差异达极显著水平,亲本间特殊配合力在单株产果量、单果质量、种仁含油率、油酸含量等重要育种形状上亦差异显著或极显著;除了含油率外,其余主要经济性状的亲本GCA方差都显著大于亲本在SCA方差,均受基因的加性效应控制为主、非加性效应次之;遗传力较低,广义遗传力在10.10%~46.80%间,狭义遗传力在0%~41.30%之间,受到较强的环境效应影响。综合分析主要育种性状的亲本GCA、SCA效应,确定优良亲本为53号和81号,优良组合为53×81和178×81,其杂交子代单株产果量分别比平均产果量高78%和35%,单果质量比平均值分别高14%和11%,风干籽出仁率比总平均值分别高8%和5%,种仁含油率提高了5%和9%。参试亲本间遗传距离在0.254 5~1.791 8间,只与油脂中油酸、亚油酸含量在0.1水平上具有相关性,与其他经济性状间无显著相关性。因此,油茶杂交育种中,除了油酸含量外,针对幼林大部分经济性状,未评估过GCA的亲本材料,先评估其GCA比评估亲本间的SCA更重要。

普通油茶两个Δ-12脂肪酸脱氢酶基因序列特征及表达模式研究

[目地]研究普通油茶油脂成分形成的调控机制。[方法]通过转录组测序获得2条普通油茶Δ-12脂肪酸脱氢酶基因序列,分别命名为Cofad6和Cofad2-2,并对这两个基因及其编码蛋白的序列特征进行比较,对其基因表达量与脂肪酸成分含量的相关性进行分析。[结果]Cofad6基因c DNA编码区全长1 347 bp,编码448个氨基酸;Cofad2-2基因c DNA编码区全长1 152 bp,编码383个氨基酸。经比对,Co FAD6蛋白与其余物种FAD6蛋白有65.7%83.68%的氨基酸同源,Co FAD2-2与浙江红花油茶FAD2-2蛋白有99.22%的氨基酸同源,与其余物种的蛋白质78.59%81.72%同源。蛋白质二级结构分析表明,Co FAD6和Co FAD2-2均具有一个脂肪酸去饱和酶结构域,属于脂酰-Co A去饱和酶基因家族;两者均为跨膜蛋白,且Co FAD2-2具有定位于内质网的保守模序。定量PCR检测发现,在普通油茶‘长林4号’无性系未成熟种子中,Cofad6表达量随着种子发育先升高后降低,而Cofad2-2基因随着种子发育表达量逐渐降低,与种子油脂中亚油酸、亚麻酸含量变化趋势呈显著正相关,与油酸含量变化呈显著负相关。[结论]推测Cofad2-2基因是调控普通油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量的关键基因之一,该研究为普通油茶油脂改良基因工程育种奠定了基础。

普通油茶和小果油茶花性状及柱头可授性

对普通油茶和小果油茶的花性状、花粉特性及柱头可授性等进行了系统研究。结果表明:普通油茶和小果油茶在花色、花瓣等性状上接近,但前者花冠直径、雄蕊数、花柱长、萼片数和单花药花粉量等花部表型性状均大于后者;两者在花粉表面纹饰等花粉形态上也有明显差异,普通油茶花粉表面纹饰呈皱波—穴网状,小果油茶花粉表面纹饰呈皱波状;普通油茶花粉活力(日均66.53%)高于小果油茶(61.78%),但两者开花后花粉活力变化和日变化趋势基本一致,开花后1-4 d的9:00-16:00花粉活力保持较高水平,为最佳传粉期;普通油茶花后柱头可授期(6 d)长于小果油茶(5 d),但两者的柱头可授性变化趋势相似,开花后1-3 d柱头活性能维持较高水平,其中花后48 h为最佳授粉时机。