伴生菌对普通生酮基古龙酸菌发酵的影响

为了实现普通生酮基古龙酸菌的单独培养和产酸,采用伴生菌巨大芽孢杆菌生长时分泌的胞外液、胞内液混合的培养方法,通过测定普通生酮基古龙酸菌单独培养时活菌数及摇瓶发酵中2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)生成情况,研究添加伴生菌胞内液和胞外液对普通生酮基古龙酸菌生长和产酸的影响。结果表明:普通生酮基古龙酸菌利用一定量的伴生菌胞外液和胞内液可以实现普通生酮基古龙酸菌的单独生长和正常产酸。

普通生酮基古龙酸菌S_2基因文库的构建和筛选

在Vc生产的第2步发酵中,普通生酮基古龙酸菌S2能利用醇醛脱氢酶,将L-山梨糖转化为Vc的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG).对普通生酮基古龙酸菌S2基因组DNA进行部分酶切,与黏粒载体pKC505连接后,用包装蛋白进行包装,转染大肠杆菌DH5α,构建成普通生酮基古龙酸菌S2基因组文库,得到12 000余个转化子.再利用纯化的醇醛脱氢酶免疫家兔制备出合格抗血清,应用免疫酶斑点技术(Dot-ELISA)对文库进行筛选,获得1个阳性克隆K719#.通过检测此基因工程菌的活性,表明在添加辅酶PQQ后,K719#具有使L-山梨糖转化为2-KLG的功能,从而使醇醛脱氢酶在大肠杆菌中得到了表达,这为简化Vc的生产工艺奠定了基础.

从D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸——Ⅰ.菌株的诱变选育和代谢产物的鉴定

2-酮基-L-古龙酸是合成维生素C的前体,以D-葡萄糖为原料经两种微生物串联发酵直接制备。本文报道了用紫外线照射和硝基胍处理等方法对2-酮基-L-古龙酸及其中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)产生菌的诱变选育。葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter sp.)SCB 611在含D-葡萄糖、玉米浆和碳酸钙的培养基中,经48小时培养后,可生成2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)。同时也选出了一株欧文氏菌(Erwinia sp.)SCB 247,它的产酸能力比前者明显要高。棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB 3058在以D-葡萄糖作为氢载体的情况下,经过三天摇瓶发酵,能将经SDS处理的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)有效地转化为2-酮基-L-古龙酸。上述菌株的代谢产物经分离提取后用熔点测定、元素分析、红外和紫外吸收光谱测定等鉴定,可以确证菌株SCB 611或(SCB 247)及菌株SCB 3058的代谢产物分别是2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)和2-酮基-L-古龙酸。

新组合菌系SCB329-SCB933利用L-山梨糖发酵产生维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的研究Ⅲ.发酵过程的特征和条件控制

在分析了新组合菌系ＳＣＢ３２９－ＳＣＢ９３３发酵过程特征的基础上，对流加发酵工艺中的种子培养、ｐＨ、溶氧的控制，以及发酵液初始培养基中的Ｌ－山梨糖浓度和流加起始点进行了优化，获得了比分批发酵更为满意的结果：发酵最终总糖达１３％（ｗ／ｖ）左右，发酵周期４０～５０ｈ，产２－酮基－Ｌ－古龙酸达１１５－１３０ｍｇ／ｍｌ，克分子转化率达８８ｍｏｌ％左右。

维生素C前体2-酮基-L-古龙酸二步混菌发酵研究新进展

维生素C(Vc)二步混菌发酵是我国首创具有自主知识产权的唯一应用于工业化生产Vc的微生物转化方法,该方法利用混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体物质-2-酮基-L-古龙酸,再经化学转化合成Vc;具有简化工艺,减少污染,降低能耗等优点。本文主要从产酸菌代谢关键酶、伴生菌胞外物质、组学以及外源添加物等方面综述Vc二步混菌发酵的最新研究进展,并提出进一步研究和探索的方向。

2—酮基—L—古龙酸高产融合子15的形态学及生理生化特征的研究

由地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｈ１９和２—酮基—Ｌ—古龙酸产生菌Ｓ１９的原生质体融合，得到了既能独立生长传代，又能产生２—酮基—Ｌ—古龙酸的１５号融合子。其菌落和菌体形态类似于Ｈ１９亲本，其生理生化特性也大多酷似Ｈ１９亲本而不同于Ｓ１９亲本。但其产生２—酮基—Ｌ—古龙酸的特性、乙醇氧化反应、石蕊牛奶产酸以及精氨酸双水解酶阴性等特点又酷似Ｓ１９亲本而不同于Ｈ１９亲本。其氧化酶反应、初始生长ｐＨ范围、苯丙氨酸和色氨酸脱氨酶反应则不同于双亲本。其菌体的氨基酸组份及含量也与双亲有一定差异。

速生型普通产酮基古龙酸菌的高通量筛选方法

建立普通产酮基古龙酸菌的高通量筛选方法,以实现快速检出生长快、高产2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)的菌株。在液体和固体培养基中分别添加混合指示剂,根据颜色变化筛选产酸相对较高的菌株;采用离心管组培养技术进行大批量培养检测。实验结果表明:固体平板上单菌落周围培养基的变色情况、变色圈大小、液体培养基的变色程度与普通产酮基古龙酸菌代谢产酸度存在一定的对应关系。通过目测可直观检出生长快、产酸高的菌株,并由此筛选得到2-KGA的高产菌种K56-1。与对照菌种相比,K56-1发酵周期缩短约2.38 h,2-KGA生成速率提升7.23%。

D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸 Ⅲ.SCB3058对2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化

棒状杆菌(Corynebactcrium sp.)突变株SCB 3058将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸转化为维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸。含2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的发酵液经表面活性剂SDS处理可直接用作菌株SCB3058的转化底物。D-葡萄糖为最佳碳源,同时作为还原的氢供体。培养基中加入NH.Cl对2-酮基-L-古龙酸的生成有明显的促进作用。转化的最适pH为7.5。摇瓶发酵64小时后,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化率为50mol%。

噬菌体对2-酮基-L-古龙酸生产的影响

研究了噬菌体对2-酮基-L-古龙酸混菌发酵的影响,在混菌培养12小时后分别接种2×105pfu/ml巨大芽孢杆菌的两种噬菌体BS601和BS801,发现:(1)噬菌体BS601虽能裂解B.megaterium,但能通过释放胞内活性物质促进K.vulgare生长,从而促进2-KLG的合成并缩短发酵周期;(2)添加噬菌体BS801能同时裂解B.megaterium和K.vulgar,导致代谢停止,无法合成2-KLG。基于上述研究结果,通过在不同发酵周期添加一定浓度的噬菌体BS601,显著提高了2-KLG的产量和生产强度。

生酮基古龙酸菌及其分子生物学研究进展

生酮基古龙酸菌是两步发酵法生产维生素C(VC)过程中的关键菌株,其能够充分转化L-山梨糖生成2-KGA,KV菌的转化代谢机制和氧化还原酶系一直是VC生产中的研究热点。KV菌的全基因组序列已经测定完成,基因注释工作正在积极推进。综述了VC生产研究进展、两步发酵法及KV菌发子生物学研究进展。指出随着研究工作的深入,越来越多的在转化L-山梨糖生成2-KGA过程中起关键作用的醇醛脱氢酶被发现。KV菌分子生物学方面的进展为革新VC生产工艺,大幅度降低生产成本,为我国的VC产业在竞争中获胜奠定了基础。

分阶段控制通风量提高2-酮基-L-古龙酸生产

考察发酵液中溶解氧对普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)和巨大芽胞杆菌(Bacillus magaterium)生长和产酸的影响,优化培养条件以提高维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的发酵收率。通过比较摇瓶条件下两菌生长和产酸曲线,提出了分三阶段控制通风量策略:即伴生菌巨大芽孢杆菌生长期(0～10h)、产酸菌氧化葡萄糖酸杆菌生长期(10h～25h)和古龙酸大量合成期(25h至发酵结束)。以菌体生长和产酸为衡量指标,对各阶段通风量进行优化,获得三阶段的最适装液量分别为95mL/750mL,95mL/750mL和70mL/750mL。通风量优化后的发酵结果较未优化前,其大菌生长速率、小菌生长速率和古龙酸的产量分别提高了14.7%、10.5%和10.9%。

巨大芽胞杆菌与普通生酮基古龙酸菌共培养过程中相互作用分子机制研究进展

混菌发酵法广泛应用于维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的生产。为进一步改善工艺,多年来,科研人员一直致力于研究发酵过程中两菌相互作用的科学本质。目前,随着组学技术、高通量技术、生物信息学和生理学等多种技术与学科的迅速发展,为深入研究相互作用分子机制提供了新的方法和工具。通过蛋白质组学、代谢组学、比较基因组学、转录组学等多种组学数据的挖掘和分析,提供了系统中各层次之间的相互作用关系网络。在此基础上结合高通量的生理学验证分析,为诠释两菌相互作用分子机制和开发代谢工程改造策略奠定了基础。本文就近些年来在该研究方向的进展及其应用进行了简要归纳,并提出进一步研究的方向。

Vc二步发酵后期补充伴生菌对发酵产古龙酸的影响

研究了Vc二步发酵后期补充伴生菌对产酸菌产古龙酸的影响。结果表明,在Vc二步发酵后期,产酸量和产酸速率低时,加入适量伴生菌(巨大芽孢杆菌)培养液或伴生活性物质对产酸菌(普通生酮基古龙酸菌)产酸有明显促进作用,提高了古龙酸产量并缩短了发酵周期。研究结果对查明Vc二步混菌发酵过程及机理、优化发酵后期工艺条件提供了理论依据。

巨大芽孢杆菌25-B对普通生酮基古龙酸菌伴生作用机理的探究

为明确Vc混菌发酵中巨大芽孢杆菌25-B(俗称大菌)对普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)的伴生作用机理,通过摇瓶发酵实验考察大菌胞外组分上清液、胞内组分上清液、全组分超声上清液对小菌伴生活性的影响,并采用超滤分级分离技术,观察大菌胞外不同相对分子质量区间的组分对小菌生长和产酸的促进作用。结果表明,大菌培养12h(产芽孢前)的胞内组分上清液和大菌培养36h(大多数芽孢随母细胞裂解释放)的胞外组分上清液均能有效促进小菌生长和产酸,且二者能力相当,说明活性物质应该是在细胞内产生,并随着芽孢形成时母细胞裂解而释放,从而对小菌产生促进作用;大菌胞外组分上清液中大于30000的组分对小菌生长和产酸的促进作用最明显。

基于基因组技术的维生素C生产菌株生理功能解析与应用

维生素C是我国主要的大宗发酵产品之一,年产量占世界总产量的80%以上。二步发酵法是维生素C工业生产的主要方法,主要通过两个发酵步骤转化L-山梨糖为2-酮基-L-古龙酸。本文综述了最近几年针对维生素C二步发酵过程关键科学问题的研究进展,重点讲述了以维生素C生产菌株基因组为基础的一系列系统生物学技术在解析维生素C生产菌株生理功能及其相互作用关系的应用,同时也为如何提高其它大宗发酵产品生产效率提供了可借鉴的方法和策略。

一株芽孢杆菌在维生素C二步发酵中对小菌的促进作用

从土壤中分离到1株能更好促使小菌生长和产酸的芽孢杆菌B601,作为伴生菌与巨大芽孢杆菌相比,在生长过程中,发酵液中B601活菌数小于巨大芽孢杆菌,而其芽孢数则多于巨大芽孢杆菌。对B601组成菌系的发酵条件进行优化,得到如下结果:100 g/LL-山梨糖、6 g/L尿素、10 g/L玉米浆、培养温度30℃和发酵周期44 h。与巨大芽孢杆菌组成菌系相比其底物L-山梨糖质量浓度提高了25%,尿素下降了50%,玉米浆质量浓度下降了33%,温度提高了2℃,发酵周期缩短了4 h。结果表明:B601作为伴生菌,与巨大芽孢杆菌相比,该菌株明显提高了发酵效率。

可产酸快生小菌的分离鉴定

目的:鉴定在实验过程中分离到的一株生长快速,并且可以将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸的菌株。方法:将快生小菌传代,并进行产酸、抗菌谱、山梨糖脱氢酶活性等分析,通过PCR方法扩增并分析16S rDNA。结果:在传代过程中还分离得到了不产酸菌株;从快生小菌中扩增得到了普通酮古龙酸菌16S rDNA;从产酸菌中能够扩增得到包含酮古龙酸菌和乙酸钙不动杆菌的16S rDNA序列;在不产酸菌中只检测到乙酸钙不动杆菌的16S rDNA序列。结论:产酸的快生小菌可能是普通酮古龙酸菌和乙酸钙不动杆菌形成的融合细胞,这种融合细胞基因组表现为很不稳定,普通酮古龙酸菌基因组容易丢失,且丢失后也失去了产酸能力。

提高维生素C二步发酵种子质量的方法

通过在维生素C二步种液培养基中添加半胱氨酸或(和)氯化钙的方法,研究了这2种物质对二步菌种生长和产2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的影响。结果表明,在二步种子培养基中加入适量的半胱氨酸和(或)氯化钙能够促进普通生酮基古龙酸菌生长,提高菌体密度,协调混菌比例,提高种子质量,并提高后续发酵2-酮基-L-古龙酸生成速率,缩短发酵周期。在种子培养基中同时加入0.3 g/L半胱氨酸和0.6 g/L氯化钙培养效果最显著:种液中普通生酮基古龙酸菌浓度提高30.77%,发酵周期缩短8.33%,2-酮基-L-古龙酸生成速率提高9.31%。

Vc混菌发酵中不同伴生菌伴生能力差异的研究

为考察不同伴生菌伴生的差异与2-酮基-L-古龙酸产量之间的关系,本研究比较了维生素C混菌发酵中2株伴生菌——巨大芽孢杆菌25B和短小芽孢杆菌HJ04的生长特性、胞外蛋白含量,并分别测定了它们与普通生酮基古龙酸杆菌组成的混菌发酵体系的抗氧化能力。结果表明:相对于25B,HJ04生长能力更强,在发酵18和42h,胞外蛋白含量分别为92.2和89.1μg/mL,分别高于前者13.6和4.8μg/mL;与普通生酮基古龙酸杆菌组成的混菌体系的总抗氧化能力在发酵18和42h分别为42.3和57.3U/mL,分别高于前者4.09U/mL(P<0.05)和2.73U/mL(P<0.05),谷胱甘肽还原酶活力为33.6和59.8U/L,分别高于前者14.5U/L(P<0.01)和6.1U/L(P<0.05);在Vc混菌发酵中2-KGA的产量提高了10.3mg/mL(P<0.05)。研究认为,伴生菌分泌活性蛋白能力及抗氧化能力与混菌体系2-酮基-L-古龙酸产量呈正相关性。

醇醛脱氢酶的分离纯化及其基因文库的构建和筛选

在维生素C的发酵生产过程中,普通生酮基古龙酸菌S2(Ketogulonigenium vulgare)能产生醇醛脱氢酶,将L-山梨糖转化为VC的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。通过超声波破碎菌体、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,QSepharose High Performance柱层析等过程,从普通生酮基古龙酸菌S2发酵液中分离纯化了醇醛脱氢酶,并用该纯化酶免疫新西兰兔制备出了合格抗血清。同时,普通生酮基古龙酸菌S2基因组DNA经Sau3AⅠ部分酶切后,与黏粒载体pKC505连接,用包装蛋白进行包装,转染大肠杆菌DH5浕,构建了基因组文库。最后应用免疫酶斑点技术(Dot-ELISA)从12000个克隆子中筛选得到一个阳性克隆K719#。通过检测该基因工程菌的活性,表明K719#具有使L-山梨糖转化为2-KLG的功能,从而使醇醛脱氢酶在大肠杆菌中获得了高效表达,这为简化VC的生产工艺奠定了基础。