美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

荧光定量PCR与普通PCR检测HBV DNA的对照分析

目的 比较普通ＰＣＲ（Ｃｏｍｍｏｎ ＰＣＲ）和实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，ＦＱ－ＰＣＲ）检测人血清ＨＢＶ ＤＮＡ结果之间的相互关系，为临床提供最有效的诊断方法。方法 对 １１７份血清标本用两种方法同时进行检测，分析其相关性，比较其差异。结果 荧光定量ＰＣＲ不仅能几乎１００％检测出普通ＰＣＲ阳性的标本，还能在其阴性的７６份标本中检测出３６份阳性，其拷贝数均在较低水平。在不同的血清标志物模式下，定量方法的阳性率均明显高于定性方法。结论 荧光定量ＰＣＲ具有一定优势，尤其适合于使用抗病毒药物的病人的疗效观察和病情预测。

qPCR-HRM曲线分析技术与普通PCR加直接测序法检测胶质瘤EGFR突变比较

目的:比较实时聚合酶链反应-高分辨率融解(qPCR-HRM)曲线分析技术和普通PCR法加直接测序法检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,探讨适用于临床的EGFR基因突变检测方法,为胶质瘤患者术后放射、化学治疗及预后判断研究提供可靠的依据。方法:用普通PCR加测序法与qPCR-HRM曲线分析技术检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,检测结果比较采用卡方检验。结果:两种方法检测EGFR外显子19基因突变结果比较差异无统计学意义,且qPCR-HRM曲线分析技术比直接测序法更快捷、灵敏。结论:与直接测序法相比,qPCR-HRM曲线分析技术可能更适用于临床检测胶质瘤患者标本EGFR突变性质。

动物源性食品鸭血中鸭成分普通PCR检测方法探究

研究鸭血因DNA部分降解而使普通PCR检测结果偏离的优化方法。对普通PCR方法未检出但实时荧光定量PCR方法检出的鸭血DNA通过增加扩增模板量到5u L,扩增产物稀释100倍进行二次扩增,可以得到的DNA纯度较高,凝胶电泳条带明亮,背景清晰,改进的方法能使普通PCR方法检测结果准确性提高,降低假阴性概率。

乳液PCR扩增复杂基因序列的方法建立及普通PCR的比较

该研究分析普通PCR的不足,通过较多实验研究初步建立乳液PCR方法,改善PCR实验技术.采用人工合成的乳酸杆菌质粒为模板,不同成分配比条件下的乳液PCR和普通PCR对质粒序列进行扩增,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后对凝胶进行Gelred染色并用GS-800灰度扫描仪成像.进一步分析乳液PCR和普通PCR扩增产物的特异性以及不同成分配比条件下乳液PCR的扩增质量.通过比较两种PCR方法的扩增结果可得,在相同条件下,乳液PCR扩增特异性高于普通PCR扩增,并确定当水相中加入100 g/L BSA,水油体积比在1∶2.5时,破乳水饱和乙醚体积比为1∶1时,水油相在1700 rpm条件下连续混合5 min时扩增效果最好.

联用普通PCR法与细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌的临床意义

目的 :探讨联用普通PCR法与细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌的临床意义。方法 :对2013年11月至2015年11月期间来我院进行体检的438例受检者的临床资料进行回顾性研究。先使用细菌培养法对所有受检者的标本进行检测,再联用普通PCR(聚合酶链式反应)法与细菌培养法对标本进行检测。然后,比较两种检测方案中脑膜炎奈瑟氏菌的检出率。结果 :单纯使用细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌的检出率为1.60%,出现1株不可分群的流脑菌株。联用普通PCR法与细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌的检出率为2.28%,不存在不可分群的现象。结论 :联用普通PCR法与细菌培养法进行脑膜炎奈瑟氏菌检测可有效地提高其检出率。此检测方法值得在临床上推广应用。

普通PCR与实时荧光PCR两种方法研究鸭血中的鸭源性成分

本研究采用普通PCR与实时荧光PCR两种方法对山东省菏泽市市售鸭血中的鸭源性成分进行检测,发现两种方法在检验结果上存在一致性。

普通PCR技术和高灵敏HBV-DNA技术检测乙肝病毒DNA的研究

目的探讨普通PCR技术和高灵敏PCR在乙肝病毒DNA检测上的临床价值。方法以2016年1月~2017年8月宜春市人民医院收治的43例肝炎患者为研究对象。分别采用普通PCR技术和高灵敏PCR技术进行检测乙型肝炎五项指标,并进行比较。结果普通PCR检测的阳性率是0,高灵敏PCR检测的阳性率是46.5%,阳性率对比差异具有统计学意义(P<0.05);在血清标志物的检测结果组合中,高灵敏PCR检测的"大三阳"、"小三阳"和"小二阳"的阳性率都显著高于普通PCR的检测结果。结论高灵敏HBV-DNA技术在检测乙肝病毒基因DNA上具有更高的准确率,可用于指导临床用药和疗效观察。

乌鳢水泡病毒(SHVV)巢式PCR检测方法的建立与应用

巢式PCR是建立在普通PCR方法基础之上的一种改进型方案,广泛用于病毒基因的检测。但是,目前还没有建立巢式PCR检测乌鳢水泡病毒的报道。本研究通过获取感染乌鳢水泡病毒的杂交鳢组织,获得病毒的相关基因,利用巢式PCR相关技术,通过体系的建立和反应程序的优化,建立一种检测乌鳢水泡病毒的方法,为及时发现并快速诊断乌鳢水泡病毒提供一项重要的技术手段。

普通PCR法、荧光定量PCR法及微流控芯片法检测大豆产品中外源基因灵敏度的比较

目的:为提高食品中转基因成分检测的灵敏度,将微流控芯片仪应用到转基因检测中。方法:将微流控芯片法与普通PCR法、荧光定量PCR法进行灵敏度比较;检测高温、高压处理过的转基因大豆粉。结果:荧光定量PCR法的灵敏度明显高于普通PCR法,但在较极端高温、高压处理(高压灭菌121℃/30 min)及转基因成分含量较低(1%)的情况下,采用荧光定量PCR法未能检测到外源基因,而微流控芯片法能检测到相应的峰值,前提是在未添加内标(Marker)的情况下。若添加内标,在内标峰和目的峰区分开的条件下,有损检测灵敏度。结论:微流控芯片在转基因检测中具有高效率、高灵敏度的特点,但该方法有待完善。

快速PCR仪与普通PCR仪扩增效果的比较研究

目的比较快速PCR仪与普通PCR仪的扩增效果。方法浓度为0.1、0.05、0.025、0.0125、0.0063ng/μL的9947A标准品各取样100例,采用Identifiler Plus试剂盒构建扩增体系,其中50例在普通PCR仪(9700型扩增仪)上进行扩增,50例在快速PCR仪(Speed cycler2扩增仪)上扩增,3500x L型遗传分析仪检测,对比每种浓度组两种扩增仪的检验结果。结果两种PCR仪的检出率均无差异(P>0.05)。但当9947A的浓度为0.0125、0.0063ng/μL时,普通PCR仪检验样本的STR基因座检出数(13.7±1.0;11.3±1.5)均高于快速PCR仪(13.1±1.3;9.9±1.9),差异有统计学意义(P=0.029;P<0.001);当9947A的浓度为0.1、0.05、0.025 ng/μL时,普通PCR仪检验样本的图谱峰高(18931±4625;13437±3165;5752±1344)均高于快速PCR仪(16929±4034;11815±4120;4865±1401),差异有统计学意义(P=0.023;P=0.030;P=0.002)。结论快速PCR仪可在较短的时间内达到与普通PCR仪相当的检出率,适合于实际案件中的应用;普通PCR仪检验获得的STR分型结果质量可能更高。

建立检测产气肠杆菌的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR方法

目的建立敏感、特异的普通聚合酶链反应（PCR）方法和Taq Man荧光定量PCR方法对产气肠杆菌进行快速检测。方法以产气肠杆菌组氨酸脱氢酶基因（hdc）为靶基因设计引物以及Taq Man FAM探针,建立对产气肠杆菌进行检测的普通PCR方法和Taq Man荧光定量PCR方法,并评价该方法的特异性、灵敏性和稳定性。结果普通PCR和Taq Man荧光定量PCR方法均能对产气肠杆菌进行特异检测;普通PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为100 copies/μl和1.0×105cfu/g,Taq Man荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为33copies/μl和1.0×104cfu/g;Taq Man荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本检测的扩增曲线良好;在稳定性评价试验中,普通PCR方法的重复性良好,Taq Man荧光定量PCR方法对质粒标准品检测Ct值的组内差异为0.15%~0.98%,组间差异为0.55%~1.63%。结论本研究建立的检测产气肠杆菌的普通PCR方法和Taq Man荧光PCR方法特异性好、灵敏度高,能够用于产气肠杆菌的快速检测。

基于UNK2基因的大豆种质资源普通PCR和实时荧光PCR检测方法

根据一种新的大豆内源特异性基因(UNK2)序列设计合成引物和探针,建立了一种基于该基因的普通PCR和实时荧光PCR检测方法。结果显示,该方法在普通PCR和实时荧光PCR检测中均具有好的特异性(普通PCR扩增产物为660 bp),而在其他作物品种上没有扩增;灵敏度试验证明,普通PCR检测灵敏度为0.03 ng,实时荧光PCR检测灵敏度为3 pg。本研究建立的方法特异性好、灵敏度较高,非常适合各口岸实验室对进出境大豆种质资源进行快速分子鉴定。

荧光定量PCR与普通定性PCR检测乙型肝炎血清HBV DNA结果的比较

目的 探讨荧光定量聚合酶链反应 (PCR)与普通定性 PCR检测血清 HBV DNA结果的差异。方法 同时采用荧光标记 (Ampli Sensor)定量 PCR方法及普通定性 PCR方法对 10 0例乙型肝炎血清样品进行 HBV DNA检测 ,并分析其相关性 ,比较其差异。结果 10 0例荧光定量 PCR方法检测 HBV DNA阳性率为 74.0 % (74/ 10 0 ) ,定性 PCR方法检测 HBV DNA阳性率为 5 2 .0 % (5 2 / 10 0 ) ,两种方法的 HBV DNA检出率比较具有显著性差异 (P<0 .0 1)。结论 荧光定量 PCR与普通定性 PCR相比具有一定的优势 ,完全可以取代定性 PCR方法 。

转基因植物中标记基因定性PCR检测方法研究

为了建立以标记基因为检测靶标的高效定性检测方法,本研究系统地分析了目前申请商业化的转基因植物中标记基因的应用频率,选取了应用频率高或在未来应用潜力大的标记基因neomycin phosphotransferaseII(NPTII)、phosphinothricin acetyltransferase(PAT)、5-enolpyrul-shikimate-3-phosphate synthase(CP4-EPSPS)、phosphinothricin acetyltransferase(bar)、hygromycin phosphotransferase II(HPTII)、β-glucuronidase(GUS)和phospho-mannose isomerase(PMI)作为检测靶标,建立了这七个基因的普通PCR和实时荧光PCR检测方法。该研究建立的普通PCR方法和实时荧光PCR方法特异性强、灵敏度高、重现性好,适用于农产品中转基因成分的大规模筛查检测,而且应用实时荧光PCR方法可大大提高检测效率,降低检测过程中样品交叉污染和环境污染的几率。

2种PCR方法检测饲料中牛和羊源性成分灵敏度

疯牛病自发生以来已给全球畜牧业带来了巨大的损失,已成为一种严重危害人类生命安全的传染病。因此,建立起有效的饲料中牛和羊源性成分的检测方法,避免带病毒的动物和饲料在市场上和国际间流通显得刻不容缓。目前,我国主要采用PCR方法进行饲料中牛和羊源性成分的检测。文章拟对普通PCR和Realtime PCR2种方法的灵敏度进行比较,希望寻找出一种有效和灵敏度更高的方法,为实际的检测工作提供依据。

弗尼斯弧菌PCR检测方法的建立及应用

弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)是近年来国内外学者公认的新食源性致病菌,对全球公共卫生和食品安全造成潜在威胁。本研究根据弗尼斯弧菌的toxS基因分别设计了普通PCR引物和实时荧光PCR引物、探针,建立了用于弗尼斯弧菌快速检测的普通PCR方法和实时荧光PCR方法,对这2种方法的特异性和灵敏度进行比较分析。研究表明,建立的普通PCR方法和实时荧光PCR方法特异性良好,检测灵敏度分别为2 400和24CFU/mL,2种方法的检测灵敏度分别是传统培养方法的10和1 000倍,同时对384份水产品和食品样品进行检测,共检出6株阳性菌株。本研究建立的基于弗尼斯弧菌toxs基因的2种PCR方法特异性均为100%,灵敏度分别为2 400和24CFU/mL,完全满足了弗尼斯弧菌的检测标准,可应用于食品样品中弗尼斯弧菌的检测。

掺杂玉米茶叶的基因组DNA提取与PCR检测方法建立

根据玉米内源ZEIN基因建立了茶叶中掺杂玉米的普通PCR和实时荧光PCR检测方法。结果表明,标准CTAB法适合提取茶叶样品基因组DNA,实时荧光PCR的灵敏度能达到0.1%,普通PCR能达到1%,实时荧光PCR是普通PCR的10倍。两种方法都能达到检测要求。

羊口疮病毒及山羊痘病毒双重PCR检测方法的建立

为实现山羊两种疫病病原体——羊口疮病毒(ORFV)和山羊痘病毒(GTPV)的同步快速检测,基于ORFV的025基因及GTPV的ITR基因,分别设计用于普通双重PCR的引物两对、用于双重实时荧光定量PCR的特异性引物及探针两套。试验结果显示,所建立的ORFV-025/GTPV-ITR-S双重普通PCR方法,可实现对GTPV与ORFV的特异性双重检测,检测敏感度可达104拷贝/μL DNA;所建立的025-ITR二联探针实时荧光定量PCR方法亦可同时特异性检测ORFV和GTPV产生特异性荧光信号,二联探针的检测敏感度可分别达102.71拷贝/μL和102.88拷贝/μL DNA。本研究初步建立了可同步快速特异性检测ORFV和GTPV的双重普通PCR及二联实时荧光定量PCR检测方法。

两种PCR方法检测感染家兔血液中弓形虫DNA的动态比较

目的:对比两种方法检测感染家兔血液中弓形虫基因动态检测结果。方法:用RH株弓形虫感染雄性家兔16只,在感染前后耳缘静脉采集血液标本。用荧光定量PCR(Fluorescence Quantitiative PCR,FQ-PCR)和普通PCR分别检测血液标本中虫体DNA基因片段。结果:FQ-PCR检测,其总阳性率为64.42%。感染家兔血液中虫体密度高峰期在感染后1～3 wk左右,其后长期维持在较低水平;普通PCR检测感染家兔总阳性率为45%。感染后第1wk检出率仅22%,高峰期维持在感染后2～4 wk,检出率约为60%左右。其后检出率下降为25%左右并一直维持。结论:两种PCR检测方法有相同的动态检出效果,采用血液作为样品进行弓形虫PCR检测时其最佳检测时间为感染后1～4 wk,其后检出率逐渐下降。