实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR检测手足口病病原体的比较分析

目的对比分析实时荧光RT-PCR和普通RT-PCR方法在检测手足口病病原体的差别。方法选择临床诊断为手足口病患者粪便256份,提取RNA,用实时荧光RT-PCR和普通RT-PCR检测手足口病肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA 16)和总肠道病毒(PE),对实验结果进行统计学分析。结果实时荧光RT-PCR和普通RT-PCR检测手足口病患者粪便标本,CoxA 16结果差异有统计学意义(P<0.01),CoxA 16阳性率分别为62.22%和16.67%;EV71、PE结果差异无统计学意义(P>0.05),实时荧光RT-PCR方法EV71和PE阳性率为42.22%和65.00%,普通RT-PCR方法为37.78%和55.00%。普通RT-PCR检测的36份EV71、CoxA 16和PE全阴性标本,荧光RT-PCR方法检出PE阳性9份、EV71阳性4份、CoxA 16阳性14份。结论实时荧光RT-PCR方法比普通RT-PCR方法更灵敏、快捷,适用于临床手足口病病原体的检测。

PPRV、RVFV、SBV三重普通及实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用研究

为同时检测小反刍兽疫病毒(PPRV)、裂谷热病毒(RVFV)及施马伦贝格病毒(SBV) 3种外来动物疫病病原,根据GenBank相关病毒序列设计引物及探针,建立PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR及三重实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步应用于临床检测。结果显示:所建立的PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法可同步特异性检测PPRV、RVFV、SBV,检测敏感度可达10~3 copies/μL DNA;对临床症状相似的羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、蓝舌病及鹿流行性出血热等病毒未有扩增。所建立的PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法对PPRV、RVFV、SBV有特异荧光信号,检测敏感度可达10~(1.33)~10~(2.13) copies/μL DNA;而对临床症状相似羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、蓝舌病及鹿流行性出血热等病毒未有荧光信号。应用PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法检测925份临床样本,检出一例PPRV阳性样本,经常规RT-PCR扩增及序列测定Blast确定为PPRV谱系IV型毒株。研究所建立的PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法和三重实时荧光定量RT-PCR方法可同步特异性检测3种病原,并初步应用于临床样本的检测。

几种外来动物病毒多重普通和实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用

为了能够同时开展对小反刍兽疫病毒(PPRV)、蓝舌病血清8型病毒(BTV8)、鹿流行性出血热血清1型病毒(EHDV1)和非洲马瘟病毒(AHSV)4种外来动物疫病病原体的核酸检测,本试验根据GenBank中相关病毒序列设计引物和探针,建立多重普通逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在采集的临床样本检测中进行初步应用验证。结果显示:建立的PPRV/BTV8/EHDV1三重实时荧光定量RT-PCR检测方法仅对PPRV、BTV8和EHDV1有特异荧光信号,检测敏感度可达10^(1.70)~10^(2.08) copies/μL DNA;建立的PPRV/BTV8/EHDV1/AHSV四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测PPRV、BTV8、EHDV1和AHSV,检测敏感度可达10^(3) copies/μL DNA;2种方法对羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、牛病毒性腹泻等临床相似的病毒均无扩增。在925份临床样本中检测出1例PPRV核酸阳性样本;经核苷酸序列测定及BLAST比对确定为谱系Ⅳ型PPRV毒株序列。本试验所建立的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法和四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测相应的3种或4种病毒病原,且具有临床样本检测的应用潜力。

实时荧光定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立

本试验旨在建立一种快速、灵敏的诊断小反刍兽疫的方法。本研究通过RT-PCR方法扩增小反刍兽疫病毒N基因,连接到pMD19-T克隆载体上,构建质粒标准品。根据GenBank中中国流行毒株及Nigeria 75/1疫苗株N基因保守序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ法进行实时荧光定量PCR,建立标准曲线,并进行特异性试验、敏感性试验和重复性试验。结果表明,在2.82×100-2.82×10^7拷贝/μL范围内,Ct值与质粒拷贝数对数值呈良好的线性关系,标准曲线线性关系R2值为0.992;其他病毒无特异性扩增曲线,特异性良好;批内变异系数为0.27%-2.77%,批间变异系数为0.41%-3.39%,重复性较好;检测灵敏度可达2.82拷贝/μL,是普通PCR的1 000倍。用该方法对12份cDNA样品进行检测,9份为阳性,3份为阴性,而普通PCR检测,7份为阳性,5份为阴性,说明本方法比普通PCR灵敏度高。本检测方法的建立对快速、灵敏诊断小反刍兽疫,防止疫情的扩散具有重要意义。

我国首例小反刍兽疫诊断报告

2007年7月我国西藏发生不明山羊疫情,国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检的14只病死山羊病料和一批血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用较敏感的小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊组织中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用次敏感的PPRV普通RT-PCR方法,从8只病羊组织中检测到PPRV核酸。针对1号样本病原核酸N基因和F基因片段进行遗传发生分析,该病原属于4系。利用竞争ELISA试剂盒对送检的13份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性。将1号组织样本接种Vero细胞分离病毒,透射电镜观察下,发现了500纳米左右的病毒粒子。对分离毒株进行PCR检测同样证实其为PPRV。

依赖解旋酶的等温扩增技术在手足口病检测中的应用研究

目的探讨依赖解旋酶的等温扩增技术在手足口病检测中的应用研究。方法选取医院收治的手足口病儿童(EV71、CA16及HFMD其他EV病原体各40例)标本。对收集手足口病病人的标本使用依赖解旋酶恒温扩增技术检测,分析依赖解旋酶的恒温扩增(RT-t HDA)技术的特异性、灵敏度和符合率进行分析。结果检测均出现特异性扩增产物,具有典型的特异条带,检测标本病毒株均呈阳性,具有较强的检测特异性。阳性检测结果的符合率为91.28%~100.00%,平均为95.24%,阴性检测结果符合率为100.00%。结论依赖解旋酶恒温扩增技术具有快速、特异、简便、经济适用性高等优势,适用于基层医疗机构临床检测,值得临床借鉴与应用。

一例PPRV阳性羊鼻拭子样本N、P、M、F、H基因的序列测定和遗传进化分析

为对采集自昆明某大型牲畜交易市场的一例PPRV阳性鼻拭子样本进行追根溯源,设计引物采用RT-PCR方法进行PPRV病毒基因组关键基因N、P、M、F、H核苷酸序列扩增,并进行序列测定和遗传进化分析。结果显示:N、P、M、F、H基因均有预期片段扩增,其读码框(ORF)长度分别为1 578、1 531、1 008、1 641及1 830 nt;N、P、M、F及H构建的遗传进化树均显示所测毒株为基因Ⅳ型,同2013年在新疆伊犁山羊中检测到的毒株(KM091959)同源性最高,N、P、M、F、H核苷酸同源性分别为99.2%、99.0%、99.4%、99.6%和99.3%,推断氨基酸同源性分别为98.7%、98.4%、100.0%、99.8%和99.3%。研究表明,检测到的毒株仍为2013~2014年我国PPRV流行期的基因Ⅳ型毒株,变异较小;所测毒株的N、P、M、F、H 5个关键基因中,M基因最保守、其次是F/H基因,而N、P基因略有变异。

3种流感病毒检测方法的比较和应用

目的探讨比较荧光定量RT-PCR、普通RT-PCR和细胞培养3种方法在流感病毒检测中的应用,从而确定每种方法各自的实用领域。方法通过荧光定量RT-PCR、普通RT-PCR和狗肾传代细胞(MDCK)培养3种方法检测398件流感样病例(ILI)咽拭子样本。比较3种方法的灵敏度和特异性。结果实时荧光RT-PCR检测阳性样本129件(阳性率为32.4%);普通RT-PCR检测出阳性样本93件(阳性率为23.4%);MDCK细胞培养法分离出流感病毒64株(阳性率为16.1%)。荧光定量RT-PCR的灵敏度达到0.01TCID50,特异性强。结论无论从敏感性、特异性还是从时间上,荧光RT-PCR对于疫情的爆发更有应用价值。细胞培养法分离流感病毒对于核实疫情的实验室诊断和病原学监测具有重大意义。