景天庚酮糖研究进展

景天庚酮糖（D-altro—heptulose）最早在1917年由LaForge和Hudson在景天科植物Sedumspectabile中发现，该糖主要分布在含多汁的肉质植物中，如景天科植物Sedum spectabile和马桑属植物Coriaria japonica含量较为丰富。景天庚酮糖在戊糖磷酸循环、植物光合作用、合成其它糖及生物合成莽草酸和芳香氨中是重要的初级和次级代谢产物。

桑树景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因的遗传转化及生物学功能分析

景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)在植物光合作用卡尔文循环过程中控制着碳的流入和再生,在碳固定的基本途径中起着重要作用。利用已克隆到的桑树景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因(MSBPase)cDNA全长序列,构建其植物表达载体转化拟南芥,检测结果表明转基因植株中MSBPase在转录水平和蛋白质水平上成功表达。对转基因拟南芥植株的表型观察发现,转基因植株与野生型植株相比叶色较绿,叶片数较多,株型较大,生长旺盛,且营养生长期明显缩短,呈现早花现象;对转基因拟南芥植株的生理生化特性分析发现,转基因株系叶片中SBPase的活性和净光合速率显著增强,叶片中的淀粉和可溶性糖含量及植株干质量增加。因此,MSBPase具有提高植株光合固定CO2的效率和光合能力,促进植株生长的作用,可以作为桑树基因工程育种的候选基因。研究结果也为进一步研究MSBPase的代谢调控机制奠定了基础。

桑树景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因的克隆、原核表达与植物表达载体的构建

景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)是卡尔文循环过程中的关键酶。利用RACE技术得到景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因全长cDNA,命名为MSBPase(GenBank登录号:DQ995346)。MSBPase全长为1527bp,该序列含有1个1179bp的完整开放读码框,编码393个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为42.6ku,等电点为5.85,其氨基酸序列与其他植物中已分离的SBPase有很高的同源性。对MSBPase编码的蛋白质(命名为MSBPase)进行结构预测分析表明,该蛋白富含无规卷曲(coil),高达64.29%,其次是α-螺旋(helix),为22.19%,而β-折叠(strand)只有13.52%。将MSBPase编码区插入原核表达载体pET30a(+),并转化到大肠杆菌菌株BL21中,经过IPTG诱导,MSBPase融合蛋白在BL21菌株中成功表达。将得到的MSBPase编码区插入植物表达载体pBI121中,构建了MSBPase植物表达载体pBI121-SBP。

粘质沙雷氏菌中果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸两个双功能酶的研究

[目的]明确粘质沙雷氏菌中两个FBPases是否同时具有催化果糖-1,6-二磷酸(F-1,6-BP)与景天庚酮糖-1,7-二磷酸(S-1,7-BP)的功能。[方法]PCR构建p ET28a-Sm-FBPase和p ET28a-Sm-Glp X,IPTG诱导表达于大肠杆菌并应用镍柱纯化靶蛋白。应用体外酶学分析Sm-FBPase与Sm-Glp X酶学特性。[结果]SDS-PAGE结果表明Sm-FBPase、Sm-Glp X的分子量是45 k Da、38 k Da。体外酶学分析表明两个酶均可催化F-1,6-BP和S-1,7-BP。Sm-Glp X是Mn2+或Mg2+依赖型酶,而Sm-FBPase的激活需要Mn2+。根据被测试的底物,Sm-FBPase最适p H 7. 0～7. 5、最适温度40℃; Sm-Glp X最适p H 8. 0、最适温度40～45℃。当F-1,6-BP作底物时,Sm-FBPase与Sm-Glp X的Kcat/Km分别为6. 88、7. 55 S-1mmol-1L。然而,当S-1,7-BP作底物时,Sm-FBPase与Sm-Glp X的Kcat/Km分别是3. 17、8. 54 S-1mmol-1L。[结论]Sm-FBPase和Sm-Glp X均可催化F-1,6-BP与S-1,7-BP,Sm-Glp X催化S-1,7-BP的效率是Sm-FBPase的2. 69倍。

外源NO对铜胁迫下小白菜SBPase基因表达特性及其光合速率的影响

【目的】本研究通过克隆小白菜光合暗反应中限制核酮糖-1,5-二磷酸(Ru BP)再生的关键酶景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(sedoheptulose-1,7-bisphosphatase,SBPase)基因,分析铜胁迫及添加外源一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)缓解铜胁迫时该基因的表达情况,并将其与对应处理下小白菜净光合速率(Pn)的变化情况结合在一起进行分析,以期为全面了解外源NO缓解铜胁迫植物光合作用机理提供理论依据。【方法】以小白菜品种"上海青"3~4片真叶大的幼苗为材料,采用RT-PCR技术克隆小白菜SBPase基因,铜处理浓度为200μmol/L,外源NO供体SNP浓度为300μmol/L,同时设置相关的4个对照组排除其他可能因素的干扰,在添加处理液后的0、4、8、12d上午九点测定各处理小白菜相同节位叶片的净光合速率,并利用实时荧光定量PCR技术检测在对应的处理时间及对应节位小白菜叶片中SBPase基因的表达情况。试验环境条件为光照强度200μmol/(m^2·s),光周期12 h,温度25℃/18℃。【结果】1)克隆得到小白菜SBPase基因(Genbank登录号:AHY18974.1),开放阅读框为1182 bp,编码393个氨基酸,蛋白质分子量为42.34k D,理论等电点为5.85。2)序列分析表明其含有氧化还原活性位点,包含一个具有59个氨基酸残基的叶绿体转移肽序列。小白菜SBPase基因推导的氨基酸序列与其他物种中已分离的SBPase编码的氨基酸序列具有很高的同源性。3)实时荧光定量PCR分析表明,SBPase基因在铜胁迫下的小白菜叶片中表达量下降,且随着胁迫时间的延长下降程度加剧;而在铜胁迫的基础上添加外源NO可以在一定程度上缓解铜胁迫引起的小白菜叶中SBPase基因表达量的下降。4)铜胁迫下小白菜叶片Pn显著下降,且随着胁迫时间的延长,Pn下降加剧,施加外源NO后Pn的下降得到一定程度的缓解,各处理下Pn的变化与SBPase基因表达量变化趋势一致。【结论】铜胁迫及在铜胁迫的基础上添加外源NO后小白菜叶片中SBPase基因表达量的变化,可能是影响对应条件下小白菜叶片的净光合速率变化的原因之一。

瓦松有效成分的研究(Ⅰ)

瓦松为景天科植物流苏瓦松Orostachys fimbriatus(Turcz.)Berger的干燥全草。为清热、解毒、止血、利湿药;治吐血、血痢、痈疔疮疖、烧伤、咬伤等。根据民间用药经验,对瓦松粗提物进行过抗肿瘤活性筛选,显示一定活性。对其化学成分进行了分离,水溶性部分分得结晶甲、乙。经初步鉴定,甲为景天庚酮糖酐(sedoheptulosan),未见瓦松属植物中有报道;乙为异丙叉景天庚酮糖酐(isopro-pylidene sedoheptulosau),可能是甲的后生产物,未见天然产物中有报道。初步药理试验表明,乙对肝癌小鼠,肝癌细胞(BEL 7402)和胃癌细胞(MGC80-3)表现出一定活性;并具有抗炎镇痛作用。

超表达杨树SBPase基因促进拟南芥光合作用及营养生长

【目的】卡尔文循环是植物光合作用中极为重要的生理过程,对植物的生长发育具有显著影响。前期研究表明,高光合速率的速生欧美杨的景天庚酮糖-1,7-二磷酸酯酶(SBPase)基因表达水平在速生期显著上调,预示该基因在光合碳固定过程中可能起着关键作用。【方法】为进一步解析SBPase在木本植物光合速率和生长发育中的作用,本文从速生欧美杨品系NE19中克隆得到了PdSBPase基因,并构建35S:PdSBP:GFP表达载体,采用农杆菌花序侵染法转化拟南芥,通过抗生素筛选,PCR鉴定和组织定位等多种方式鉴定并成功得到了超表达PdSBPase拟南芥株系。【结果】在正常生长状态下,超表达植株的叶面积、根长、株高都优于野生型和突变体,其中叶面积是野生型的1.79倍,根长是野生型的1.93倍,而突变体表现为植株矮化,叶子明显发黄短小,叶绿素含量低于野生型株系。转基因株系SBPase酶活是野生型1.4倍,是突变体的1.9倍,RuBP产量以及淀粉含量均要高于野生型和突变体株系,RuBP产量分别是野生型和突变体的1.37和1.76倍,转基因株系的淀粉含量达到了50.26μg/g,而突变体的淀粉含量未检出。【结论】这些结果说明,PdSBPase对RuBP的形成和淀粉等多糖的合成起到关键作用,能促进植物积累更多的碳水化合物,进而正向调控植物的光合能力。

蓝藻FBP/SBPase的制备及其与配体相互作用的分析--科研转化的化学生物学综合实验设计

以蓝藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶为靶酶,异源表达获得靶酶,分析靶酶的纯度及含量,探讨配体与靶酶的相互作用。通过本实验,学生掌握获取靶酶的方法,掌握靶酶与配体相互作用的分析方法,了解药物筛选模型建立的研究思路及实验技术,提升分析、解决问题及综合运用知识的能力,增强科研服务社会意识及责任感。

甜菜SBPase基因的遗传转化

利用转基因方法在甜菜中适度表达光合作用相关的关键酶(景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶,SBPase),具有提高光合效率,提高甜菜产量的潜力。本研究以甜菜叶柄为受体材料,构建携带SBPase基因的植物表达载体,通过农杆菌介导法进行遗传转化;利用RT-PCR技术检测转基因植株中SBPase基因的表达情况;通过微滴数字PCR技术筛选低拷贝转基因植株。在所检测的抗性植株中获得转录水平上表达的SBPase转基因甜菜植株8株,其中低拷贝株系2株,为探索甜菜产量形成机理,创制高产新种质奠定了基础。