高温胁迫下景宁木兰淀粉与蔗糖代谢途径转录分析

【目的】从分子生物学角度探究景宁木兰Magnolia sinostellata能否适应城市高温环境,为木兰属Magnolia植物城市推广应用和胁迫分子研究奠定基础。【方法】采取人工控制实验,对景宁木兰幼苗进行40℃极端高温处理,测定果糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉碳同化产物,以及果糖磷酸酶、蔗糖磷酸合成酶,进行了转录组测序。【结果】随着胁迫时间的延长,景宁木兰叶片果糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉质量分数发生一定的变化,但是差异不显著(P>0.05),果糖合成酶活性呈现显著下降趋势(P<0.05),蔗糖合成酶变化不显著(P>0.05)。转录组数据进一步揭示了在高温胁迫下,相比于24 h,48 h时景宁木兰叶片调节淀粉合成的SS(Unigene 40295)、Glc-1-pa(Unigene 38453)、GBE(CL4668.contig3)基因的表达量增加,随着高温胁迫的加深,调节蔗糖合成的SPS基因呈现下降趋势,并通过荧光定量验证了以上结果。【结论】景宁木兰对极端高温(40℃)有一定的短时耐受性,为应对高温胁迫,不但碳同化产物发生显著变化,调控淀粉与蔗糖代谢途径的关键基因表达也发生了变化,进一步证明了高温会导致景宁木兰叶片内蔗糖和淀粉的相互转化。

濒危植物景宁木兰分布特征及其与生境土壤性质的关联分析

以位于浙南山区的丽水市莲都区峰源乡为研究地点,调查濒危植物景宁木兰(Magnolia sinostellata)的种群分布情况,采集生境土壤样品测定理化指标,并采用灰色关联分析法探讨土壤性质对景宁木兰分布特征的影响。结果表明:景宁木兰主要分布在公益林,萌生能力极强,但大部分植株的每丛萌条数量不多;分布区生境土壤pH均值4.96,含水率极低,有机质丰富,有效磷明显不足,上层植被不是影响居群间土壤性质差异的唯一因素;关联分析显示,景宁木兰的分布情况和生境土壤的pH值、有效磷和速效钾3个理化指标关联密切,其中pH值的影响程度最高,与景宁木兰植株数关联度最大的是中土层有效磷含量,与平均每丛萌条数关联度最大的是表土层pH值。

景宁木兰TCP家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析

为明确TCP转录因子家族在景宁木兰(Magnolia sinostellata)遮阴胁迫中的作用,通过模拟自然生境对景宁木兰3 a生嫁接苗进行遮阴处理,基于转录组分析TCP转录因子相关信息,利用转录组表达量和qRT-PCR分析遮阴胁迫下的表达模式。结果表明,从景宁木兰转录组中筛选出12个TCPs基因,编码蛋白长度为228~558个氨基酸,分子量为23.7~52.7 kDa,TCPs蛋白均为不稳定蛋白、亲水性蛋白;TCPs均定位于细胞核,MsTCP20-a/b蛋白还定位于叶绿体。TCPs成员分为2大类,ClassⅠ包含10个TCPs成员,ClassⅡ包含2个TCPs成员。所有成员均含有TCP保守结构域,亲缘关系较近的成员具有相似的保守基序;克隆得到TCPs启动子序列,其序列含有大量光响应和激素响应元件。在遮阴处理后景宁木兰TCPs基因存在差异表达,其中MsTCP9-a与MsTCP2在遮阴后显著上升,MsTCP8、MsTCP9-b、MsTCP7-a、MsTCP15在遮阴后显著下降。因此,景宁木兰TCPs可能在响应遮阴胁迫过程中发挥重要功能。

极小种群植物—景宁木兰压条繁殖技术研究

以极小种群植物—景宁木兰植株2-3a生枝条进行压条繁殖,研究压条部位(枝条上段和中段)、枝条刮皮(刮皮长度2cm,深至韧皮部)、生根剂(20%萘乙酸粉剂按100mg/L浓度兑水)对其成活率及发根量的影响。结果表明:枝条刮皮、生根剂、压条部位对成活率及发根量均有影响。当其它试验因素和水平相同时,枝条经刮皮的成活率及发根量比未刮皮的高,采用枝条中段压条的成活率及发根量比上段的高,使用生根剂的成活率及发根量比未使用的高。采用枝条中段、枝条经刮皮处理、使用生根剂的处理苗木成活率及发根量最高,成活率82.22%,发根量6.68根。

景宁木兰花粉萌发与贮藏特性研究

以景宁木兰的花粉为试材,采用花粉离体培养法,用单因子与正交试验研究不同浓度蔗糖、H3BO3、CaCl2所组成的基本培养基对景宁木兰花粉萌发的影响,同时探讨不同贮藏条件和贮藏时间对花粉活力的影响。结果表明:景宁木兰在30 g·L-1蔗糖+200 mg·L-1H3BO3+200 mg·L-1CaCl2的液体培养基上萌发率最高(74.56%)。低温条件下有利于景宁木兰花粉生活力的保持,在-80℃条件下,花粉生活力下降较慢,并且随着贮藏时间的增加,经过硅胶干燥的花粉的活力明显高于湿润花粉的活力。

景宁木兰穴盘扦插繁殖技术研究

运用不同基质、不同生根剂等处理方式对景宁木兰进行穴盘扦插,结果表明:嫩枝插穗生根率高于老枝插穗。1/2蛭石+1/2珍珠岩基质栽培,ABT 1处理的嫩枝生根率最高;1/3素砂+1/3蛭石+1/3珍珠岩、1/3素砂+1/3珍珠岩+1/3泥炭土基质栽培,ABT 1与IBA处理的嫩枝与老枝均不生根。

景宁木兰热胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选

高温对景宁木兰Magnolia sinostellata生长产生严重影响。通过筛选景宁木兰热胁迫下稳定表达的内参基因,可以为景宁木兰在高温条件下基因表达研究提供准确数据,达到对目的基因进行准确量化的目的。以热胁迫下景宁木兰1年生实生苗的根、茎、叶组织为材料,从转录组数据库中选取13个管家基因ACTIN-7(肌动蛋白基因-7),CYP(亲环蛋白基因),EF-1α(延伸因子-1α蛋白基因),GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因),GTB(GTP结合蛋白基因),NAC(NAC域蛋白基因),NADP(异柠檬酸脱氢酶基因),TEF(翻译延伸因子基因),UBC(泛素化酶基因),UBQ(多聚泛素蛋白基因),α-TUB(α微管蛋白基因),β-TUB(β微管蛋白基因)和18S(18S核糖体RNA),通过Primer 5.0进行引物设计,琼脂糖电泳和溶解曲线分析验证引物特异性;利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术和geNorm,NormFinder和BestKeeper等3个内参分析软件研究候选内参基因在热胁迫下不同组织中的表达稳定性,并通过CSLD3和KOR 2个目的基因的表达分析验证其可靠性。13个内参基因的电泳结果均显示单一条带,溶解曲线也均显示单一峰,证明引物特异性良好;13对引物的扩增效率均在100%左右;内参软件综合分析得到,UBC,EF-1α和ACTIN-7是景宁木兰在热胁迫下较为稳定的内参基因,以3个单独的内参基因以及内参组合(EF-1α和ACTIN-7)为参照对CSLD3和KOR的表达模式进行校准,也显示了一致的表达水平。通过qRT-PCR技术和内参软件分析,UBC,EF-1α和ACTIN-7等3个内参基因在景宁木兰热胁迫下不同组织中稳定性较高,CSLD3和KOR等2个目的基因的表达也证实了其可靠性。因此,UBC,EF-1α和ACTIN-7可以作为景宁木兰热胁迫下稳定表达的内参基因。

景宁木兰组织培养外植体选择与抗褐化研究

该研究以景宁木兰(Magnolia sinostellata)为材料,从外植体类型的选择、消毒时间、预处理方法、离体培养条件和抗褐化剂类型选择等方面进行综合研究,以期筛选出景宁木兰组织培养的最佳方案。结果表明:利用0.1%氯化汞(HgCl_2)浸泡处理14和8 min分别是景宁木兰叶片和带芽茎段、根部的最佳消毒时间;景宁木兰叶片及茎段的褐化率在暗培养7 d时,分别为60.00%和56.67%,14 d时显著升高,而根部则在暗培养14 d时褐化率最低(45%);利用1 g·L^(-1)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)浸泡预处理景宁木兰外植体6 h可显著降低(P<0.05)其褐化程度,处理后叶片、带芽茎段和根部的褐化率分别降至45.00%、28.33%和63.33%。不同的抗褐化剂均可减轻外植体的褐化程度,但针对不同外植体其效果不同。景宁木兰叶片最佳抗褐化剂为0.02 g·L^(-1)硝酸银(AgNO_3),可使其褐化率降低至16.67%,成活率为11.67%;带芽茎段和根部的最优抗褐化剂为2 g·L^(-1)柠檬酸(CA),褐化率分别降至30.00%和5.00%,成活率依次为50.00%和76.67%。综上所述,带芽茎段和根部抗褐化处理后褐化率较低且成活率较高,为景宁木兰组织培养最佳外植体。

景宁木兰与木兰属其它植物之间亲缘关系与遗传基础研究

采用ISSR(Inter simple sequence repeat)分子标记研究景宁木兰(Magnolia sinostellata)与17个木兰科木兰属其它植物之间的亲缘关系,揭示景宁木兰的遗传基础。在本试验条件下,从120个ISSR引物中筛选出20个具有多态性的引物,共检测到178条清晰的条带,其中163条具有多态性,占91.60%。通过POPGENE 32软件分析,除了木兰亚属的山玉兰独自成一类外,符合赫钦生的木兰属分类系统:厚朴、广玉兰及其变种为木兰亚属一类,其余包括景宁木兰、天目木兰、武当木兰等为玉兰亚属一类;玉兰与辛夷的杂交种二乔木兰与辛夷的遗传距离最近,为0.231 4,与玉兰的遗传距离也只有0.316 7;木兰属内遗传距离最近的为天目木兰与日本辛夷,为2.232 1,遗传距离最远的为山玉兰与日本辛夷,为0.736 9;景宁木兰与本属其它植物间的遗传距离在0.278 2～0.610 9,其中与天目木兰的遗传距离最近,为0.278 2,与山玉兰的遗传距离最远,为0.610 9。这表明景宁木兰具有其特有的遗传基础,且与天目木兰亲缘关系最近。

珍稀濒危植物──景宁木兰的保护及发展

景宁木兰具有较高的观赏价值和较大的学术价值，因其野生种群数量少，加上人为破坏严重，刚刚发现就濒临灭绝。建议将该种列入国家珍稀保护植物，并加强对其人工栽培技术的研究。

景宁木兰生物生态特性的初步研究

为了保护和合理利用景宁木兰这一珍贵自然资源，采用调查与试验相结合的方法，对景宁木兰的形态特征、生长规律、繁殖技术及生态特性进行了比较系统研究，结果表明，景宁木兰的树形树冠、花形花色都具有开发潜力，适生条件要求不严，无性繁殖和种子繁殖的成功使开发利用成为可能。

景宁木兰(Magnolia sinostellata)远缘杂交授粉过程障碍研究

以景宁木兰(Magnolia sinostellata)为亲本,分别与望春玉兰(M.biondii)、紫玉兰(M.liliiflora)、红运二乔(M.soulangeana‘Red lucky’)、丹馨玉兰(M.soulangeana‘Danxin’)进行种间远缘杂交,并以景宁木兰自交为对照,研究了景宁木兰自交和杂交亲和性。结果表明:(1)景宁木兰具有较高的花粉活力与柱头可授性,花粉管能正常进入杂交母本花柱,自交结实率为2%;(2)以景宁木兰为父本,紫玉兰柱头对其花粉具有较好的识别性,花粉萌发率和花粉管生长速度均高于以红运二乔和丹馨玉兰做母本的组合,花粉管生长较为正常,结实率为25%,而与红运玉兰杂交的结实率为4%,与丹馨玉兰杂交的结实率为0%;(3)以景宁木兰为母本,望春玉兰花粉在其柱头上的萌发比率高于其他4个组合,但花粉管生长过程中出现扭曲,景宁木兰花柱内出现胼胝质沉积,且最终并未获得种子。花粉管发育镜检结果表明:受精前障碍即花粉管进入花柱基部前生长异常是引起景宁木兰与丹馨玉兰、望春玉兰杂交不结实的主要原因;并进一步推测花粉管进入子房后的异常状态是导致景宁木兰自交,与红运二乔杂交结实率低的主要原因。

景宁木兰PIF转录因子的生物信息学分析及极端遮阴条件下的表达模式

【目的】群落所造成的遮阴是导致景宁木兰Magnolia sinostellata濒危的重要因素之一。PIF家族转录因子在光信号传导和植物生长发育中起到重要作用。对PIF家族转录因子进行系统分析和研究,为探究其在景宁木兰光信号转导机制中的作用奠定基础。【方法】从景宁木兰转录组数据中鉴定获得PIF家族转录因子并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术对其在极端遮阴条件下的表达模式进行分析。【结果】从景宁木兰转录组中共筛选出9个MsPIFs转录因子基因,其编码的蛋白质长度为188~735个氨基酸,蛋白质大小为20 314.56~78 957.02 Da,理论等电点范围为5.18~8.22。MsPIFs基因编码的蛋白质均为不稳定蛋白质,所有蛋白质均为亲水性蛋白质。亚细胞定位预测结果显示所有蛋白质均定位于细胞核。9个蛋白质均具有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Try)磷酸化位点。qRT-PCR结果表明:极端遮阴条件下,9个MsPIFs家族基因表达均发生不同程度的变化。其中,MsbHLH23的表达变化较其他基因更为明显,遮阴处理5和10 d时的表达量分别上调为对照的52.77与20.03倍。【结论】景宁木兰PIF转录因子家族均能响应遮阴,为后续对MsPIFs进行生物学功能鉴定奠定了基础。

不同光照强度下濒危植物景宁木兰幼苗光合特性的季节变化

【目的】探讨濒危植物景宁木兰Magnolia sinostellata在不同光照强度下光合能力的季节变化及适应机制,为种群的繁衍复壮和迁地保护等提供理论依据。【方法】以2年生景宁木兰幼苗为对象,在3种光照处理下(100%全光照、40%全光照和10%全光照),对春季、夏季、秋季3个季节的光合特性指标进行了测定与分析。【结果】(1)春季100%全光照和夏季100%全光照、40%全光照下净光合速率日变化均呈“双峰”曲线。(2)夏季100%全光照、40%全光照下最大净光合速率、光饱和点、光补偿点均显著高于10%全光照(P<0.05),而秋季100%全光照下最大净光合速率、光饱和点却显著低于40%全光照和10%全光照(P<0.05)。(3)夏季、秋季100%全光照下最大电子传递速率和磷酸丙糖利用率均显著低于40%全光照(P<0.05)。(4)100%全光照下光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光化学量子产量在夏季、秋季分别为0.68和0.72。100%全光照下光化学猝灭系数和40%全光照下PSⅡ实际光化学量子产量在夏季均显著高于春季、秋季(P<0.05)。【结论】在100%全光照下,景宁木兰易受夏季高温和强光胁迫,致使叶片灼伤,秋季净光合速率明显下降,而适当遮光条件下,景宁木兰在3个季节均能维持较高的净光合速率。因此,在景宁木兰栽培过程中,建议光合有效辐射保持在自然光照强度的40%以上。

景宁木兰原生地植物多样性及其保护现状评价

依托景宁木兰遗传多样性保育及其在中国东南地区原生境的回归引种项目,开展景宁木兰的就地保护实践。对景宁木兰4个原生地的生态环境、伴生种、个体数量进行考察,对该种的生存状况进行评价,对今后的就地保护工作提出建议。

景宁木兰保护生物学研究进展

景宁木兰Magnolia sinostellata是浙江特有种,为浙江省重点保护濒危植物。本文从分布特征、繁育系统、遗传多样性、逆境胁迫等方面综述了过去30余年(1984年首次被发现至2021年)国内外学者对于景宁木兰的保护生物学研究的成果,梳理了景宁木兰濒危的主要原因:(1)花粉进入柱头后存在受精障碍导致自交和杂交不育或少育;(2)群落结构单一且不稳定;(3)群落形成的遮阴削弱了景宁木兰幼苗的生长势。探讨了目前的研究存在的问题,认为对于景宁木兰雌雄配子体和胚胎发育的研究仍存在空白,无性繁殖技术体系还不成熟,缺少景宁木兰与其他物种的种间关联研究。提出今后应综合各学科的技术手段对景宁木兰开展长期且系统的监测研究,以期更深入地了解景宁木兰的濒危机制,为景宁木兰的保护和繁育提供理论依据。

景宁木兰花粉生活力测定

以景宁木兰花粉为材料,分别用TTC染色法、离体萌发法和过氧化物酶测定法测定景宁木兰花粉活力,结果表明,TTC染色法和过氧化物酶测定法不能准确表示景宁木兰花粉的生活力;在离体萌发法测定景宁木兰花粉活力时,培养基中添加蔗糖、硼酸对景宁木兰花粉萌发影响较大,添加5%蔗糖和0.01%硼酸比较适合景宁木兰花粉萌发;景宁木兰花粉在室温下其生命力一般保持16～20 d,4℃低温贮藏可使花粉生活力时间延长至26～30 d。

景宁木兰濒危原因初探

调查了景宁木兰的种群数量、开花物候、花部性状、花粉流及授粉方式,总结了景宁木兰的花期和花器官构造等特征,分析了景宁木兰濒危的原因,并提出采取人工授粉等措施,以提高景宁木兰的结果率。

景宁县畲乡草鱼塘国家森林公园景宁木兰资源调查与保护

采用实地踏查法,对浙江景宁县畲乡草鱼塘国家森林公园内景宁木兰种质资源进行了调查。结果表明:景宁木兰分布于该森林公园内海拔950~1250 m的低山区域,调查总共发现有野生景宁木兰群落7个211丛,其中:位于草鱼塘埔垟林区5个167丛;茶叶队群落1个22丛;新发现位于草鱼塘梨树岙水背头顶景宁木兰群落1个22丛。可见通过三年的景宁木兰种苗培育及时将大苗种植至景宁县森林公园、国有林场,扩大种群规模,为进一步开发利用和研究提供了物质基础。

景宁木兰播种育苗技术研究

指出了景宁木兰无性繁殖程度大,开展保护繁育研究对景宁木兰具有重要的现实意义,就景宁木兰种子采集与处理、圃地选择、播种、苗期管理及换床移栽等方面的播种育苗技术进行了探讨。