超抗原SPE-G蛋白的表达纯化及晶体筛选

超抗原是一种主要由金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌产生的蛋白毒素,其与主要组织相容性复合体Ⅱ类分子和T细胞受体结合,在极低浓度下即可非特异地激活大量T细胞,产生极强免疫应答效应。链球菌致热外毒素G(SPE-G)是典型超抗原之一,但迄今尚无对SPE-G的结构生物学研究。通过原核表达、纯化得到高纯度SPE-G蛋白,利用坐滴法对蛋白结晶条件进行筛选,最终获得了性状较好的SPE-G晶体,为SPE-G蛋白结构解析及更深入的研究奠定了基础。

UI9600晶体管参数筛选仪存储时间测试一致性改造

由于双极型三极管的开关时间参数在节能灯失效中的影响越来越受到重视,三极管存储时间ts的分档也越来越细,导致仪器UI9600晶体管参数筛选仪间的存储时间ts测试一致性成为关键。从该仪器的测试电路着手,通过改造达到消除仪器间的存储时间ts测试差异。

一种高效分离埃可病毒30型病毒颗粒及其晶体培养方法的建立

目的建立高效培养,分离纯化埃可病毒30型(echovirus 30, EC30)的有效方法并筛选优化病毒晶体生长条件,为后续病毒疫苗开发及病毒结构功能研究建立基础。方法先利用人胚胎横纹肌肉瘤细胞系(human embryonic rhabdomyosarcoma cell,RD)培养、生产在2010年广西手足口病疫情中分离到的埃可病毒30型毒株;而后使用蔗糖密度梯度离心法分离纯化病毒颗粒;再用透射电镜观察病毒颗粒的形态;最后使用Hampton晶体试剂盒筛选并优化病毒晶体适宜生长条件。结果经透射电镜验证获得完整形态病毒颗粒并在p H 4.6的醋酸钠溶液中培养得到高质量的病毒颗粒晶体。结论通过RD细胞培养结合蔗糖密度梯度离心法可获得高纯度病毒颗粒;利用试剂盒筛选可获得高质量的病毒蛋白晶体。

火球菌RecJ蛋白的表达纯化及结晶

RecJ蛋白是一类在细菌和古菌中高度保守的蛋白,在细胞内参与同源重组、甲基指导的碱基错配修复和碱基切除修复等过程。RecJ蛋白除了可以从单链DNA的5端降解DNA外,还可以从单链RNA的3端降解RNA。为能够从结构上阐明古菌火球菌(Pyrococcus furiosus)RecJ蛋白在细胞内的功能和其对不同底物(RNA/DNA)的降解活性的影响,本实验采用蛋白质晶体学的方法,通过蛋白质的表达纯化,晶体筛选得到了火球菌RecJ蛋白的晶体,并通过结晶条件的初步优化得到了有衍射的晶体。

牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277菌株外切聚磷酸酶的表达、纯化和结晶

外切聚磷酸酶(exopolyphosphatase,PPX)对于细菌在恶劣环境下引起的严紧反应、病原菌的致病性和抗生素耐药性等生物学过程必不可少。牙龈卟啉单胞菌是与牙周炎关系最密切的病原菌。为解析牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277菌株的外切聚磷酸酶(PgPPX)的结构,首先利用大肠杆菌对PgPPX蛋白基因进行克隆与蛋白表达,然后依靠谷胱甘肽巯基转移酶标签对融合蛋白亲和层析后,采用阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱得到表面电荷、聚合形态均一的PgPPX蛋白,最后对纯化后的目的蛋白进行结晶条件筛选。结果表明:PgPPX蛋白在溶液中表现为二聚体形式,纯度大于98%,表达量高达30 mg/L,且该蛋白在0.2 mol/L MgSO 4·6 H 2O、20%PEG3350(m/V)条件下获得的晶体形状较好。

铜绿假单胞菌寡核苷酸酶的纯化、结晶和活性验证

目的:研究致病菌铜绿假单胞菌寡核苷酸酶(PaOrn)的三维结构和体外水解活性,验证PaOrn活性位点并探讨PaOrn对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)胞内3',5'-环二鸟苷(c-di-GMP)水平和致病毒性的影响。方法:构建重组质粒pET 32M3C-PaOrn,在大肠杆菌(E.coli)BL21中诱导表达目的蛋白,获得组氨酸(His)标签和谷胱甘肽(GST)标签标记。采用多级纯化方法纯化蛋白,经Ni亲和层析、GST亲和层析和阴离子交换层析后获得高纯度和高均一性PaOrn目的蛋白。采用商业化结晶试剂和坐滴法筛选晶体,根据晶体状态进一步优化。采用X射线衍射法验证晶体质量,分辨率高于3Å时用于结构解析。采用高分辨质谱技术Q TOF验证PaOrn蛋白水解底物二鸟苷磷酸(pGpG)活性,鸟苷单磷酸(GMP)产物作为验证活性的指标。采用尿素聚丙烯酰胺(Urea-PAGE)法验证PaOrn蛋白和点突变PaOrn蛋白(Orn^(D11A)、Orn^(E13A)、Orn^(D111A)、Orn^(H157A)和Orn^(D162A))对10 nt长度寡核苷酸RNA的水解活性,降解条带作为活性正常的分析指标。结果:经原核系统表达和多级纯化,得到纯度高达95%的目的蛋白PaOrn。于结晶试剂WizardⅠ#12[1.0 mmol·L^(-1)(NH4)2HPO4,0.1 mmol·L^(-1) Imidazole]pH 8.0条件下生长出质量较好的单晶,晶体PaOrn的分辨率为1.85Å,复合物PaOrn-GMP和PaOrnD11A-pGpG的分辨率分别为1.90Å和1.70Å。高分辨质谱,PaOrn将底物pGpG水解为GMP。尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳,PaOrn可降解长达10 nt的RNA,当活性位点Asp11、Glu13、Asp111、His157和Asp162分别突变后,PaOrn丧失活性,无法降解底物pGpG和RNA(10 nt)。结论:PaOrn通过降解寡核苷酸参与调控胞内c-di-GMP和RNA水平,影响转录起始和细胞多种生物学行为。

Effects of temperature on the dynamic evolution of two-photon photorefractive screening spatial solitons

We investigate theoretically the temperature effects on the evolutions of both bright and dark screening spatial solitons in biased two-photon photorefractive crystals.For a stable bright or dark two-photon screening spatial soliton originally formed in a crystal at a given temperature,when the crystal temperature changes,it will evolve into another stable screening soliton if the temperature change is quite small,while it will become unstable or break down if the temperature change is large enough.The spatial shape of a stable two-photon screening spatial soliton can be changed by appropriately adjusting the crystal temperature.