晶状体蛋白截短导致先天性白内障的两个家系致病基因分析

目的:通过使用全基因组外显子测序确定两个先天性白内障家系的致病基因变异。方法:对2019-2020年在首都医科大学附属北京同仁医院就诊的2个先天性白内障家系部分成员进行详细的临床眼科检查及全身查体。采集先证者及亲属外周血并提取基因组DNA,应用全外显子测序筛查可疑致病基因,并对家系全部成员进行Sanger测序验证候选致病变异位点。结果:经过外显子测序及生物信息学分析,家系1中在CRYBB1基因中存在无义变异c.656G>A,造成βB1晶状体蛋白质第219位色氨酸变异为终止密码子(p.W219X),最终产生晶状体蛋白截短。家系2中的发现在CRYGD基因中存在无义变异c.337C>T,造成γD晶状体蛋白质第113位谷氨酰胺变异为终止密码子(p.Q113X),导致晶状体蛋白截短。结论:位于CRYBB1基因的无义变异c.656G>A是导致家系1出现先天性白内障的病因;位于CRYGD基因的无义变异c.337C>T是导致家系2出现先天性白内障的病因。

先天性白内障晶状体蛋白致病基因及其功能研究进展

先天性白内障病因复杂,遗传性因素占22.3%。晶状体蛋白基因占突变基因的50.0%,包括α-晶状体蛋白、β-晶状体蛋白、γ-晶状体蛋白,其突变的致病机制主要是通过改变蛋白的二级或三级结构干扰蛋白质正确折叠方式从而影响蛋白的溶解度和稳定性,并形成细胞毒性的聚集小体;干扰蛋白与蛋白之间的相互作用并诱导细胞凋亡;消除三磷酸腺苷拮抗聚集效应等,目前针对致病机制的初步药物研究有羊毛甾醇等,可为治疗白内障提供新思路。因此,本文就晶状体蛋白基因的突变及其功能研究进行综述。

非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的细胞核转运及其选择性杀伤肿瘤细胞机制的研究

非晶状体βγ晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物(βγ-CAT)是从大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离的分子量为72kDa的天然蛋白复合物。本研究通过激光共聚焦显微镜和Western blot分析βγ-CAT在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的细胞核转运机制,以及βγ-CAT对多株肿瘤细胞(HCT116,HT29,A375,Hela,THP-1等)的细胞毒效应。结果表明:βγ-CAT的α亚基中含有典型的GTP/ATPase的保守结构模体Walker A和Walker B,体外检测到βγ-CAT具有GTP/ATP水解酶和GTP/ATP结合活性。在细胞核转运过程中,βγ-CAT的α亚基和β亚基参与形成约150kDa含有泛素化修饰信号的大分子复合物,且泛素化修饰信号和βγ-CAT的α亚基和β亚基共定位于细胞内和融合于细胞核区域的转运囊泡小体中。βγ-CAT能够选择性的杀伤肿瘤细胞,诱导肿瘤细胞脱落和发生凋亡。上述结果为进一步深入研究βγ-CAT的细胞核转运和调节细胞功能的分子作用机制提供思路和线索。

电镜分析非晶状体βγ晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物在人红细胞膜上的孔道形成效应

非晶状体βγ晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物(non-lens βγ-crystallin and trefoil factor complex,βγ-CAT)是一个从大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离的天然分子量为72kDa的全新的蛋白复合物。本研究测定了βγ-CAT处理红细胞后引起细胞内钾离子外流与溶血效应的时效曲线,结合扫描电子显微镜和透射电子显微镜分析βγ-CAT处理红细胞引起的早期形态学变化。结果表明:βγ-CAT(3nmol/L)37℃处理红细胞5min,(93.31±5.89)%的细胞内钾离子迅速外流(P<0.01),相应溶解率为(13.12±1.92)%(P<0.05)。电子显微镜观察发现红细胞形态发生明显变化,细胞体积增加,肿胀。少数红细胞表面向外形成棘状异常突起,部分肿胀细胞内的血红蛋白通过棘状突起缺口向细胞外喷射血红蛋白。表明βγ-CAT通过在红细胞膜上形成孔道使细胞内钾离子迅速外流导致红细胞内渗透压改变而溶血。其结果为理解βγ-CAT的溶血机制提供了直接的形态学证据。

非晶状体βγ晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物诱导兔胸主动脉环内皮依赖的持续收缩效应(英文)

脊椎动物中,非晶状体βγ-晶状体蛋白广泛分布于各种组织,但是功能知之甚少。三叶因子在创伤修复与肿瘤发生中具有重要作用,其分子作用机制尚不清楚。非晶状体βγ晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物(βγ-CAT)是一个从大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离的一类全新的蛋白复合物。研究表明,βγ-CAT能够诱导离体的兔胸主动脉产生快速而持续的收缩,结合药理学抑制剂,细胞培养,激光共聚焦显微镜和免疫荧光原位组化,从细胞和分子水平对其作用机制进行研究。结果表明:βγ-CAT诱导兔胸主动脉产生的收缩效应为剂量依赖(2—35nmol/L)和内皮依赖(P<0.01)。在βγ-CAT(25nmol/L)处理的主动脉环的内皮细胞层检测到肿瘤坏死因子-α的释放。同时,βγ-CAT能够诱导原代培养的兔胸主动脉内皮细胞(RAEC)快速释放肿瘤坏死因子-α,βγ-CAT(25nmol/L)分别处理5和30min,RAEC释放的肿瘤坏死因子-α的浓度分别为(34.17±5.10)pg/mL和(98.01±4.67)pg/mL(P<0.01)。表明肿瘤坏死因子-α在βγ-CAT诱导兔胸主动脉产生的收缩效应中发挥重要作用。为进一步深入研究非晶状体βγ晶状体蛋白与三叶因子的生理功能提供了新的思路和线索。

水溶性及水不溶性晶状体蛋白质的研究

目的 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PACE)的方法对水溶性及水不溶性晶状体蛋白质进行分离分析,以完善晶状体蛋白质组的研究。方法 用12%分离胶对晶状体水溶性蛋白(WSF)及脲溶性蛋白(USF),碱溶性蛋白(ASF)及超声溶性蛋白(SF)进行SDS－PAGE。用8%及3%－8%的梯度分离胶对WSF及USF进行SDS-PAGE。结果USF,ASF,SF和 WSF相比有明显差异。WSF及 USF在相对分子质量＞100000处可显示出数条清晰的蛋白谱带。结论水溶性高相对分子质量晶状体蛋白及水不溶性晶状体蛋白在双向凝胶电泳中不能很好地分离,而在单向电泳中可分离出特异性蛋白谱带,此结果是对晶状体蛋白质组研究的一种有效补充。

兔α-晶状体蛋白的分子伴娘功能的研究

目的了解兔α－晶状体蛋白是否具有分子伴娘功能。方法凝胶过滤法分离水溶性晶状体蛋白。在５５℃高温条件下，观察。一晶状体蛋白是否能抑制β－ｌｏｗ晶状体蛋白的凝集和变性；观察α－晶状体蛋白是否能抑制糖基化诱导的葡萄糖－６－磷酸脱氢酶（Ｇ６ＰＤ）的失活，均以牛血清白蛋白（ＢＳＡ）作为对照。结果α－晶状体蛋白能抑制热诱导的β－ｌｏｗ晶状体蛋白的凝集和变性；α－晶状体蛋白亦能抑制糖基化诱导的Ｇ６ＰＤ的失活；而牛血清白蛋白却无此作用。结论α－晶状体蛋白具有分子伴娘功能。

非晶状体βγ-晶状体蛋白的研究进展

βγ-晶状体蛋白是主要分布于脊椎动物眼睛晶状体内的水溶性结构蛋白。非晶状体βγ-晶状体蛋白从微生物到高等哺乳动物都有过报道。微生物中发现的非晶状体βγ-晶状体蛋白主要作为环境胁迫应急蛋白,在恶劣环境中发挥对细菌的自我保护作用,如ProteinS。在哺乳动物中,非晶状体βγ-晶状体蛋白被推测能够参与胚胎的皮肤发育与分化调节,具有肿瘤抑制等重要的生理功能,如黑色素瘤缺失蛋白。但是,对于它们的生化特性、生理功能和作用机制知之甚少。本文从蛋白结构、基因起源和生物学功能等方面简要介绍目前非晶状体βγ-晶状体蛋白的相关研究进展。

老年性白内障与正常晶状体蛋白质双向电泳的差异

目的:应用双向电泳技术对比研究老年性白内障与正常晶状体,寻找差异表达的蛋白质。方法:分别收集老年性白内障和正常晶状体,采用固相pH梯度(IPG)等电聚焦双向电泳技术进行蛋白质分离,使用ImageMaster图像分析软件分析电泳图像,对比分析蛋白质表达的差异。结果:大部分晶状体蛋白质分布在Mr14000～97000,等电点(pI)5～9的范围内;高丰度蛋白质斑点分布在Mr20000～31000、等电点(pI)6～8的区域内。经软件分析正常组共识别出133±7个蛋白质斑点,白内障组共识别出136±8个斑点,两组之间的匹配率为87%(115个),其中有8个点蛋白质表达量增加了300%以上,其中44号增加了480%,有6个点蛋白质表达量减少了300%以上,其中125号减少了336%。结论:老年性白内障与正常晶状体存在差异表达的蛋白质。

糖基化对α-晶状体蛋白的修饰和分子伴侣活性的降低

目的 研究糖基化对 α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用。方法 分离牛晶状体α-晶状体蛋白 ,分别与 0 .5 mol· L- 1 果糖和 0 .5 m ol· L- 1 葡萄糖在 37℃温育 ,在第 0、2 4、32天测定 380 nm的光吸收值和 40 0 nm非色氨酸荧光值 ,高压液相色谱 ( high performanceliquid chrom atography,HPL C)和 SDS- PAGE评价蛋白质交联程度 ,采用过氧化氢酶( catalase,CAT)和βL-晶状体蛋白的热凝聚光散射值 ,作为α-晶状体蛋白的分子伴侣活性指标。结果 果糖和葡萄糖可导致时间依赖性 α-晶状体蛋白在 380 nm吸收值的增加 ,非色氨酸荧光值升高 ;HPL C和 SDS- PAGE提示糖与α-晶状体蛋白形成交联复合物。果糖较葡萄糖作用明显。糖基化导致 α-晶状体蛋白抑制 CAT和 βL-晶状体蛋白热凝聚作用降低 ,孵育第 2 4天 ,葡萄糖组α-晶状体蛋白分子伴侣活性分别降低约 12 %和 19% ,果糖组约7%和 9% .结论 糖基化导致 α-晶状体蛋白形成高分子聚合物、凝聚、交联 ,分子伴侣活性丧失 ,这在老化和糖尿病性白内障形成过程中起重要作用。

三氯乙酸/丙酮蛋白质提取法在白内障晶状体蛋白提取中的应用

目的：比较不同蛋白质提取方法在白内障晶状体蛋白提取中的效果，寻找适合白内障晶状体蛋白质组学研究的蛋白质提取方法。 方法：采用裂解液溶解白内障晶状体组织样本，超声裂解离心后分别采用三氯乙酸/丙酮法和 ReadyPrep 2 D Cleanup Kit对晶状体蛋白样本进行提取、二维电泳，并对电泳后凝胶进行染色、图像采集和图像分析。 结果：在2-DE图谱上蛋白斑点的相对分子量在14～97．4kDa之间，等电点在5～9之间，其中高丰度蛋白相对分子量处于20～31 kDa范围内，低丰度蛋白斑点相对分子量处于31～43 kDa范围内。经TCA/丙酮沉淀法处理的含有透明质酸钠白内障晶状体蛋白样本，二维电泳凝胶图谱背景较清晰，蛋白斑点较清楚，共检测到35～40个左右的蛋白斑点。 结论：在人白内障晶状体蛋白质组学研究中，TCA/丙酮法具有较好的纯化效果，为人晶状体组织蛋白质组学的质谱分析研究提供了可靠的二维电泳凝胶图谱。

紫外线辐射对α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用

目的 研究在老化和白内障形成过程中紫外线 (UV)辐射对α 晶状体蛋白分子伴侣活性的作用。方法 新生Sprague Dawley大鼠皮下注射亚硒酸钠诱导硒性白内障 (SC) ,采用SephacrylS 3 0 0HR分离幼年和老年兔晶状体皮质和核以及SC大鼠α 晶状体蛋白。以α 晶状体蛋白对过氧化氢酶热凝聚的抑制作为分子伴侣活性指标 ,观察UV B (3 0 0nm )辐射α 晶状体蛋白后 ,其伴侣活性的变化。结果 UV辐射新生和老年兔晶状体核αL 晶状体蛋白后 3 0h ,与辐射前比较伴侣活性降低约 18%和 14 % ,而皮质的变化不显著 ;至 10 0h时 ,老年兔皮质、核和新生兔核αL 晶状体蛋白的伴侣活性分别下降 8%、2 7%和 2 3 %。辐射第 192h ,正常大鼠和SC晶状体αH 和αL 晶状体蛋白的伴侣活性显著降低 ,正常组分别下降 3 5 %和 2 3 % ,SC组下降 3 1%和 10 %。结论 UV B辐射可降低α 晶状体蛋白的分子伴侣活性 ,并呈时间依赖效应。UV辐射对老年α 晶状体蛋白分子伴侣活性影响比幼年显著 ,晶状体核比皮质对UV辐射敏感 ,αH 晶状体蛋白比αL 晶状体蛋白敏感。UV辐射可进一步降低硒性白内障α 晶状体蛋白的分子伴侣活性。

热休克对心肌细胞中αB-晶状体蛋白移位及表达的影响

采用热休克对新生大鼠心肌细胞进行处理 ,观察αB 晶状体蛋白在细胞内的分布及其表达变化。结果 :①Western blot显示热休克后胞浆中可溶性αB 晶状体蛋白迅速移位至细胞内的不溶性结构中 ,2h左右基本复位 ;②免疫双荧光细胞化学显示热休克导致αB 晶状体蛋白在细胞浆内发生分布变化 ,而HSC70从胞浆向胞核移位 ;③免疫电镜定量分析进一步证实αB 晶状体蛋白在热休克时主要移向Z线及核膜等细胞骨架部位 ;④Northern blot显示热休克诱导心肌细胞αB 晶状体蛋白mRNA的表达增加。热休克处理使αB 晶状体蛋白迅速移位至细胞骨架 ,表明其在心肌预适应早期相中可能发挥保护作用。而αB 晶状体蛋白的诱导表达 ,可能是心肌预适应延迟相保护的重要机制之一。

αB-晶状体蛋白在先天性白内障大鼠晶状体中免疫活性的变化

目的观察正常以及先天性白内障大鼠晶状体中αB-晶状体蛋白的免疫活性变化,探讨其与白内障发病的关系。方法分别摘取8周龄、10周龄、12周龄、14周龄正常对照组以及先天性白内障大鼠晶状体,应用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合体法,观察不同时期大鼠晶状体中αB-晶状体蛋白的免疫活性变化。结果αB-晶状体蛋白在各周龄正常大鼠晶状体上皮细胞及纤维部具有较高的表达。在8周龄、10周龄先天性白内障大鼠晶状体上皮细胞及纤维部可观察到与正常对照组相同的较强的免疫活性,而12周龄、14周龄鼠的白内障晶状体纤维部αB-晶状体蛋白的免疫活性明显低于正常对照组。结论在12周龄、14周龄先天性白内障大鼠晶状体纤维部,αB-晶状体蛋白的免疫活性减弱,在白内障形成过程中αB-晶状体蛋白可能被一些蛋白酶水解分化,从而促进白内障的形成。

αA晶状体蛋白的功能及其在相关眼部疾病中的作用

αA晶状体蛋白是晶状体中重要的蛋白成分,具有分子伴侣活性,可调控凋亡、新生血管形成、氧化还原过程及炎症反应,其功能已成为研究热点之一。现在越来越多的研究证实,αA晶状体蛋白不仅存在于晶状体中,也存在于视网膜等其他眼内结构中,不仅可维持内环境的稳定,还在各类眼部疾病,如视神经损伤类疾病、视网膜变性类疾病、眼肿瘤、炎症类疾病和视网膜脉络膜血管类疾病等中表现出相应的变化。本文就αA晶状体蛋白的分布、基本结构、功能及其在眼部疾病中的作用进行综述。

糖皮质激素对α-晶状体蛋白分子伴侣功能的影响

目的 研究糖皮质激素对α 晶状体蛋白分子伴侣功能的影响。 方法 凝胶过滤层析分离αL和βL 晶状体蛋白,αL 晶状体蛋白与 25mmol/L泼尼松龙 21 半琥珀酸(P 21 H)孵育 20d(37℃),分别于 0、2、4、10和 20d应用βL 晶状体蛋白热聚集法测定分子伴侣活性,采用PerkinElmerLB50B荧光光度仪观察色氨酸和非色氨酸荧光值,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳监测蛋白质交联程度。 结果 被P 21 H修饰后的αL 晶状体蛋白分子伴侣功能显著降低。P 21 H可导致αL 晶状体蛋白色氨酸荧光强度明显降低,非色氨酸荧光强度向较长波长移位和增强,提示形成新的荧光色素物。孵育第 10d,伴侣活性已降低至约 3 3%,色氨酸荧光强度殆尽,约在激发波长 412nm出现新的非色氨酸荧光强度。SDS PAGE显示糖皮质激素导致αL 晶状体蛋白明显凝聚。 结论 糖皮质激素对α 晶状体蛋白的修饰和伴侣活性的降低可能参与糖皮质激素诱导白内障的形成。

晶状体蛋白αB对卵巢癌细胞恶性行为的影响

目的研究晶状体蛋白αB(αB-crystallin)在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞SKOV3增殖及迁移侵袭能力的影响。方法免疫组织化学法检测人正常卵巢组织和上皮性卵巢癌组织中αB-crystallin表达;针对蛋白αB-crystallin的基因(CRYAB基因)设计合成靶向小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)重组慢病毒,并感染人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3;流式细胞仪、平板克隆、MTT检测细胞凋亡和增殖;Transwell检测细胞迁移和侵袭能力;Western blot检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。结果αB-crystallin在卵巢癌组织中表达高于正常卵巢组织,在Ⅱ型卵巢癌组织中呈明显高表达(P<0.01),稳转CRYAB si RNA慢病毒后SKOV3细胞内αB-crystallin蛋白表达降低64%,其凋亡和增殖无明显改变,但SKOV3细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制(P<0.01),同时蛋白MMP-2和MMP-9表达下调(P<0.01)。结论αB-crystallin能够影响卵巢癌SKOV3细胞浸润转移,其在Ⅱ型卵巢癌组织中的高表达可能与其高侵袭潜能相关。

常染色体显性先天性后极性白内障一家系晶状体蛋白基因突变分析

目的检测一个常染色体显性先天性后极性白内障家系的晶状体蛋白（CRYAB）基因突变,并分析其与白内障的关系。方法收集该家系患者及健康者外周血标本并抽提基因组DNA。通过PCR扩增及DNA测序对常染色体显性先天性后极性白内障患者的23个候选基因进行筛选,并以体检健康者作为健康对照。用Prot Scale和Prot Param在线软件比较分析野生型和突变型αB-晶状体蛋白结构与功能,结合患者临床数据和裂隙灯照片进行综合分析。结果家系中所有患者8~10岁开始出现视力下降,均在晶状体后极存在单一且界限清晰的混浊,直径0.5~3 mm。DNA测序证实患者携带全新的CRYAB杂合错义突变（c.59C〉G）,导致氨基酸P20R的改变。该家系中健康人和200例体检健康者未发现此突变,排除单核苷酸多态性（SNPs）的可能。生物信息学软件分析结果表明P20R突变改变了αB-晶状体蛋白的生化性质。结论从一个家系常染色体显性先天性后极性白内障中发现了CRYAB杂合错义突变（c.59C〉G,p.P20R）,此突变与先天性白内障相关。

晶状体蛋白的外消旋化及其在白内障发病机制中的研究进展

外消旋化是老年人晶状体蛋白中重要的翻译后修饰类型.多项研究发现,随着年龄的增长,α-、β-及γ-晶状体蛋白中的部分L型氨基酸残基倾向于通过外消旋化反应转化为D型氨基酸残基,导致晶状体蛋白的构象改变,聚合形成的大分子蛋白质在晶状体核区和皮质中逐渐积累,晶状体蛋白失去了原有功能而不能维持晶状体的透明度.外消旋化在晶状体蛋白年龄相关性改变中的效应和参与程度,及其对白内障发生与进展的具体机制都值得进一步研究.

α晶状体蛋白对脂多糖诱导的视网膜小胶质细胞增生及TNF-α表达的影响

目的观察α晶状体蛋白对脂多糖(LPS)诱导的视网膜小胶质细胞增生及肿瘤坏死因子α(TNF-α)生物学活性的影响。方法原代培养视网膜小胶质细胞,并采用CD11b细胞免疫荧光及流式细胞仪鉴定纯度,加入α晶状体蛋白及LPS后,通过MTT(四氮唑蓝比色细胞增生测定)检测α晶状体蛋白对LPS活化的小胶质细胞增生能力的影响,并采用ELISA、RT-PCR检测TNF-α蛋白水平及mRNA水平表达的变化。结果原代培养的小胶质细胞经免疫组织化学鉴定及流式细胞仪鉴定纯度分别达到95.8%和91.4%,经10-4g/Lα晶状体蛋白预处理后,LPS诱导的小胶质细胞增生被抑制(P<0.01);与未处理组比较,TNF-α蛋白质量浓度及mRNA表达量明显降低(P<0.05)。结论α晶状体蛋白可以减少LPS诱导的原代培养视网膜小胶质细胞增生及TNF-α表达。