日本血吸虫热休克蛋白70在昆虫细胞Sf9中的表达鉴定

本研究旨在用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达日本血吸虫热休克70蛋白(SjHSP70),获得重组的rSjHSP70蛋白。利用PCR技术从日本血吸虫cDNA文库中克隆SjHSP70全长序列;亚克隆到pFastBacHTA中,构建重组杆状病毒转移载体pFastBacHTA-SjHSP70,导入DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒reBacmid-SjHSP70,再转染到Sf9昆虫细胞制备重组病毒;将重组病毒感染细胞,用间接免疫荧光技术鉴定重组蛋白的表达;His柱亲和层析法纯化目的蛋白;Western blot技术对纯化蛋白进行抗原性鉴定。SjHSP70基因全长序列1962 bp,在Sf9昆虫细胞中获得高效表达;His柱亲和层析法纯化表达的蛋白可被日本血吸虫感染小鼠的阳性血清识别。用杆状病毒昆虫细胞表达系统成功表达了SjHSP70,为深入研究SjHSP70分子的免疫生物学功能提供了材料。

克氏原螯虾热休克蛋白70基因表达的定量研究

根据实验室克隆的克氏原螯虾（Procambarus clarkii）HSP70（SCHSP70）的核酸序列，制备内部缺失42bp的核酸片段作为竞争性模板。采用竞争性RT-PCR的方法，定量测定克氏原螯虾组织的SCHSP70mRNA的袁达量。结果显示，SCHSP70有广泛的组织分布，但是在正常情况下表达量均较低。经2h热休克处理，7种组织的SCHSP70 mRNA的表达量均显著上升，表明该SCHSP70可能是一种热诱导型HSP70。心脏组织scHSP70在热激前后的表达量均较高，分别为1．12×10^5和4．80×10^5分子／ug总RNA。而血细胞中SCHSP70的表达在热激前后均处于最低水平，分别为0．191×10^4和1．61×10^4分子μg总RNA。在0～8h长时间的热休克实验中，心脏组织scHSP70的表达随着热休克时间的延长，呈现增强的趋势，提示心脏组织在虾类的应激反应中发挥了重要的作用。

牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70的克隆与原核表达重组质粒的构建

为了构建牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70（HSP70）基因片段原核重组表达质粒，本试验根据Gen-Bank上登录的牛瑟氏泰勒虫热休克蛋870基因序列（D12692．1），应用PrimerPremier5．O软件设计合成一对特异性引物，以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板，扩增片段大小为1692bp，与参考序列的同源性为99％。将该基因与pET-28a（＋）载体进行连接，

日本血吸虫SjC23-Hsp70 DNA疫苗与IL-12对水牛保护性作用的研究

目的：研究日本血吸虫中国大陆株23 kD膜蛋白-热休克蛋白（SjC23-Hsp70）DNA疫苗联合佐剂白细胞介素12（IL-12）质粒DNA对水牛的免疫保护作用。方法：将血吸虫病非流行区8~10月龄健康水牛45头随机分为A组（SjC23-Hsp70＋IL-12）、B组（SjC23＋IL-12）和C组（pVAX＋IL-12）,每组15头。每头牛经肩部肌注免疫3次,每次间隔28 d。末次免疫后28 d,每头牛感染日本血吸虫尾蚴1000条。解剖前2天及当天分别收集粪便1次,用定量法检测虫卵和毛蚴数。攻击感染后56天解剖所有水牛,经胸主动脉灌冲法收集成虫,计数成虫数,检测每克肝组织虫卵数。结果：A,B组与C组相比,分别获得45.70%和26.61%的减雌率,44.51%和25.84%的减虫率,41.10%和31.63%的减粪卵率,48.11%和38.07%的减毛蚴率及43.39%和31.95%的减肝卵率。A组的5个率均比B组高（P〈0.05）。结论：用SjC23-Hsp70 DNA疫苗和IL-12联合免疫水牛可获得明显的免疫保护作用。

血吸虫受发育调节的相关蛋白及其功能的研究

血吸虫生活史各阶段可作为血吸虫疫苗和药物介入的靶阶段。对血吸虫不同发育阶段蛋白分子和基因表达的动态变化的了解 ,有助于探索其生长发育的机制 ,为研制有效的阻断传播的疫苗和新的药物提供科学指导。

日本血吸虫热休克蛋白70(Sj HSP70)的抗体反应特征及免疫诊断价值

目的制备重组日本血吸虫中国大陆株热休克蛋白[rSj HSP70（Grp78）],检测其抗体反应特征及用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA,采用基因特异性引物,通过PCR技术扩增编码Sj HSP70（Grp78）成熟肽的基因片段,并将该片段插入到表达质粒pET28a（＋）中,构建表达质粒HSP70（Grp78）-pET28a。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达后采用镍亲和层析法制备纯化的可溶性rSj HSP70（Grp78）。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）及Western blot检测rSj HSP70（Grp78）的抗体反应特异性及抗rSj HSP70（Grp78）IgG在血吸虫感染小鼠血清中动态变化,以分析其早期诊断与疗效考核价值,并比较rSj HSP70（Grp78）-ELISA与SEA-ELISA检测血吸虫感染者血清抗体IgG的敏感性与特异性。结果编码Sj SP70（Grp78）成熟肽基因片段克隆成功,并获得纯化的分子质量单位约69ku的重组表达Sj HSP70（Grp78）蛋白。Western blot显示Sj HSP70（Grp78）蛋白能被日本血吸虫感染的小鼠及人血清识别,但不与华支睾吸虫病和卫氏并殖吸虫病患者血清及健康人、鼠血清反应。感染小鼠血清抗Sj HSP70（Grp78）IgG水平与血吸虫感染度呈正相关,并随着感染时间延长呈增强趋势,在感染后16~18周达到峰值,随后开始回调,但始终维持在较高水平。治疗组小鼠经药物治疗后第2周（感染后第8周）,体内抗体水平迅速上升并达到高峰,经过短暂下降后再次上升,出现第二个高峰,随后逐渐回调,至治疗16周（感染后第22周）,部分小鼠抗体水平已接近阴性阈值。部分个体在血吸虫感染后1周即可检测到血清抗rSj HSP70（Grp78）IgG。分别以rSj HSP70（Grp78）和SEA血吸虫、华支睾吸虫及卫氏并殖吸虫感染者血清及健康人血清,敏感性分别为82.9%和95.7%,特异性分别为94.3%和85.7%,与健康人血清的交叉反应率分别为0和16.67%,与华支睾吸虫感染者血清的交叉反应率分别为5.7%和14.29%;与卫氏并殖吸虫感染者血清的交叉反应率分别为5%和65%。结论 Sj HSP70（Grp78）具有高度的抗原特异性,以此为抗原采用ELISA检测抗Sj HSP70（Grp78）IgG具有日本血吸虫病辅助诊断价值,并具有一定的早期诊断与疗效考核潜能。

克氏原螯虾一种诱导型HSP70基因克隆及分析

克氏原螯虾是我国淡水虾类养殖的重要品种,具有很强的抵御各种环境胁迫和各种刺激的能力。本文以该虾为对象,通过基因克隆以及从基因水平探讨HSP70s与环境应激之间的关系,为深入研究水生无脊椎动物HSP70s功能提供基础。采用RT-PCR和RACE方法从克氏原螯虾(Procambarus clarkii)心脏组织中克隆得到一种HSP70 cDNA(scHSP70),其全长为2271bp,包括1902bp的完整编码序列、142bp的5′及221bp的3′端非翻译区,GenBank登陆号DQ301506。基因组DNA扩增表明该基因仅由一个外显子组成。根据cDNA序列推导出scHSP70由635个氨基酸组成,分子量为69.6kD,理论等电点为5.34。该序列存在真核细胞HSP70家族的三个特征标签。SWISS-MODEL蛋白三维结构预测显示scHSP70在N端形成ATP酶结构域,在近C端形成底物肽结合结构域。克氏原螯虾在系统发生树上的进化地位与传统分类学相一致。半定量RT-PCR实验表明,scHSP70有广泛的组织分布,在心脏中表达量最高,在血液中最少。热激后该基因大量表达,说明该基因是一种诱导型HSP70。这为从蛋白水平研究克氏原螯虾HSP70与环境应激之间的关系提供基础。

血吸虫病兔疫诊断研究进展

血吸虫病免疫诊断自本世纪50年代以来有了很大发展.可以说,所用抗原涉及血吸虫生活史中各个时期;所用方法包括了补体结合、间接血凝、胶乳凝集、凝胶电泳(或扩散)、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、放射免疫测定以及环卵沉淀试验等.免疫诊断的依据长期来主要为检测特异抗体.由于抗体在宿主体内长期持续存在,甚至经过有效治疗后粪便中已找不到虫卵,抗体仍长期不能消失,因此不能用于区分活动性感染和既往感染,也无法反映治疗的效果.而检测循环抗原则可弥补上述之不足.因此许多学者对之竞相研究,特别是引入单克隆抗体技术,使得检测的敏感度和特异性都有显著提高.

日本血吸虫热休克蛋白70诱导BALB/c小鼠皮肤炎症反应的实验研究

目的观察重组日本血吸虫热休克蛋白70(rSj648/hsp70)诱导BALB/c小鼠皮肤炎症反应的变化情况。方法 BALB/c小鼠经腹部皮内分别免疫注射LPS(20μg/只)、rSj648/hsp70(100μg/只),同时设PBS处理组为空白对照。通过苏木素伊红(HE)染色观察免疫后第1、2、4、7天小鼠腹部皮肤的炎症反应变化,并利用Real-timePCR方法检测不同时间点各组小鼠皮肤组织IFN- γmRNA的表达水平。结果通过HE染色观察发现LPS组小鼠腹部皮肤组织在免疫后第1天炎症细胞浸润明显,之后炎症反应开始逐渐减轻;与LPS组相比较,rSj648/hsp70组小鼠腹部皮肤炎症反应强度大,持续时间长,直至免疫后第7天炎症反应仍明显。Real-time PCR结果显示,免疫后第1天,LPS组和rSj648/hsp70组小鼠皮肤组织的IFN- γmRNA表达水平均升高,之后LPS组逐渐降低,而rSj648/hsp70组直至免疫后第7天仍持续高表达。结论 rSj648/hsp70能使小鼠皮肤出现较强的以诱导产生IFN-γ为主的Th1优势免疫应答,进一步提示了HSP70高表达可能与致弱尾蚴诱导宿主产生抗感染免疫力有关。

克氏原螯虾对高温应激的生理学响应

本实验旨在研究高温对克氏原螯虾(Procambarus clarkia)血液生化指标、抗氧化能力以及热休克蛋白70基因表达的影响。实验分别采用30℃和35℃水温进行高温应激试验,应激前(0 h)和在应激后3、6、12、24和48 h分别采集样本,测定血淋巴液中LDH、GLU、TCHO、TP和TG含量,测定肝胰腺T-AOC、CAT、MDA以及HSP70基因的表达变化。结果显示:在高温应激的初级阶段(6 h),克氏原螯虾血淋巴中的TCHO和LD含量急剧上升,而GLU含量持续上升到24 h;TG含量在应激的初级阶段变化不明显,但在6 h后急速上升,在12 h达到最高后开始回落;TP的含量在初级阶段出现下降,然后在12 h恢复至应激前水平。肝胰腺中的MDA含量在应激后持续上升,在24 h后达到最高值,随后下降至应激前水平;T-AOC在应激后3 h上升至最高水平,随后降低;CAT的含量分别在应激后6 h和12 h上升至最高值然后回落。HSP70基因在应激前未检测到有表达,高温应激后3 h即可检测到少量表达,35℃组在6 h出现大量表达,并持续到12 h,随后24 h降低至无法检出;而30℃组在应激6 h后降低至无法检出。结果表明,30℃和35℃高温能引起克氏原螯虾机体产生应激反应,并对机体的生理机能产生影响。