替唑尼特结合物酶解条件的确定

[目的]为替唑尼(T)在狗体内的药代动力学研究提供依据。[方法]以健康狗口服硝唑尼特后的血浆为材料,研究了不同处理(水、酶液、缓冲液、处理时间)对葡萄糖醛酸替唑尼特(TG)的降解效果。[结果]加水1μl和加水1μl放置1 h处理的T峰面积差异不明显。加入酶液、缓冲液和放置不同时间处理的T峰面积有显著差异。向血浆中加入20μl pH值为4.3的醋酸-醋酸钾缓冲液、2μlβ-葡萄糖醛酸苷酶、37℃恒温过夜酶解条件下,T的峰面积最大,较处理前明显升高。经该条件酶解处理后,血浆中只能找到T,而酶解处理前能找到T和TG。[结论]得到了能够完全水解狗血浆中替唑尼特葡萄糖醛酸结合物的酶解条件。

替唑尼特对脂多糖诱导RAW264.7细胞氧化应激及炎症因子的影响

本研究通过脂多糖(LPS)诱导大鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)建立氧化应激模型,探讨替唑尼特(TIZ)的抗氧化和抗炎效果。培养RAW264.7细胞,给予LPS(1μg/m L)刺激并用TIZ(25、50、75、100μmol/L)作用。MTT法检测细胞存活率;DCFH-DA荧光探针法检测TIZ对ROS生成的影响;同时,检测MDA的生成量以评估TIZ对脂质氧化的影响;检测GSH的含量以及CAT、SOD、GSH-Px酶活性以评估TIZ对细胞抗氧化系统的影响;检测IL-6的分泌和COX-2的表达量以评估TIZ对炎症细胞因子的作用。结果显示LPS刺激后细胞表现出显著性的氧化应激效应,而给予TIZ处理后,ROS和MDA生成量呈剂量相关性的显著下降;细胞IL-6的分泌和COX-2的表达量也随TIZ处理而显著下降,而GSH含量以及CAT、SOD、GSH-Px活性在TIZ处理后却呈剂量相关性的显著性上升。因此,TIZ可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞氧化应激和炎症反应,这为TIZ的作用机制研究以及应用奠定了基础。

RP-HPLC法测定狗血浆中硝唑尼特代谢产物的浓度

建立了检测狗血浆中硝唑尼特主要代谢物替唑尼特浓度的高效液相色谱法,并用于药代动力学研究。该法采用Scienhome Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH值为2.5()505∶0)为流动相,流速为1.0 ml/min;紫外检测波长为360 nm;柱箱温度为30℃;进样量为30 lμ。结果表明:在0.1～12.5μg/ml的浓度范围内与峰面积呈良好线性关系,相关系数为0.999 6(n=5;)最低检测浓度为0.02μg/ml;日内RSD<4.9%(n=6);日间RSD<5.7%(n=6);回收率为99.63%～112.7%。该法具有快速、简便、灵敏的特点,适用于硝唑尼特的药代动力学研究。

应用质谱中性丢失扫描鉴定狗血浆中硝唑尼特Ⅱ相代谢物

硝唑尼特经狗口服后在体内迅速代谢成替唑尼特,随后替唑尼特进一步与葡萄糖醛酸结合生成了葡萄糖醛酸替唑尼特结合物。本实验主要运用了三重四极杆串联质谱的中性丢失扫描功能,并结合质谱的全扫描功能和酶解试验,成功地对该硝唑尼特Ⅱ相代谢物进行了鉴定。

液质联用测定犬血浆中硝唑尼特主要活性代谢产物的试验

为了研究硝唑尼特在Beagle犬体内的药代动力学特征,试验用液质联用方法检测硝唑尼特的主要代谢产物——替唑尼特。结果发现：替唑尼特在0.05-25μg/mL范围内线性关系良好,r=0.999 9（n=7）,该方法日内精密度〈1.5%（n=3）,日间精密度〈3.0%（n=3）。说明该方法灵敏度高,操作简便,可以用于硝唑尼特在犬体内的药代动力学研究。

硝唑尼特改善西方饮食诱导的ApoE^(-/-)小鼠脂肪肝作用的代谢组学研究

硝唑尼特(nitazoxanide)是一种临床抗原虫药物,本课题组前期研究发现口服途径给予硝唑尼特可改善西方饮食(Westerndiet,WD)诱导的ApoE小鼠肝脏脂肪样变,尚待深入阐明其机制。本文通过非靶向代谢组学研究硝唑尼特对西方饮食诱导的ApoE^(-/-)小鼠肝脏代谢谱的影响,进而通过细胞水平实验研究其潜在机制。采用UPLC-MS联用法对小鼠的肝脏组织代谢物进行非靶向代谢组学研究;筛选差异代谢物,并对差异代谢物进行富集分析和通路分析;采用硝唑尼特的体内代谢产物替唑尼特处理肝细胞,在代谢组学发现的基础上研究硝唑尼特改善肝脏脂代谢异常的潜在机制。硝唑尼特改善西方饮食诱导的ApoE^(-/-)小鼠肝脏代谢紊乱,主要通过调控甘油磷脂代谢、D-谷氨酰胺和谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢和精氨酸生物合成。硝唑尼特的体内活性代谢产物替唑尼特(tizoxanide)增加HepG2细胞谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量并促进谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligasecatalytic subunit,Gcl-c)和谷胱甘肽还原酶(glutathionereductase,Gsr)的mRNA表达;增加肝细胞胱硫醚β合酶(cystathionineβ-synthase,CBS)和磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶(phosphatidylethanolamineN-methyltransferase,PEMT)蛋白水平,抑制游离脂肪酸(free fattyacid,FFA)诱导的肝细胞脂质蓄积;替唑尼特可增加FFA刺激下HepG2细胞及小鼠原代肝细胞中S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase,SAHH)蛋白表达;替唑尼特提高HepG2细胞N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase,Nags)和氨基甲酰磷酸合成酶1(carbamoylphosphate synthetase1,Cps1)mRNA表达水平。综上所述,硝唑尼特改善西方饮食诱导的ApoE^(-/-)小鼠肝脏脂肪样变的潜在机制包括增加CBS表达、提高肝细胞内谷胱甘肽含量,增加肝细胞PEMT蛋白水平,增加肝细胞Nags和Cps1的表达。

山羊组织中硝唑尼特代谢产物的液相色谱-串联质谱检测

以替唑尼特为检测对象,建立了一种检测山羊组织中替唑尼特残留的液相色谱-串联质谱分析方法。样品经正己烷脱脂、乙腈提取,收集提取液于60℃水浴氮气吹干,乙腈溶解,经0.22μm微孔滤膜过滤后,采用多反应监测模式进行分析。结果显示,对于肝样品,替唑尼特在0.25～25μg/kg范围内线性关系良好(r2>0.99),检测限和定量限分别为0.1μg/kg和0.25μg/kg;对于肾、肌肉、脂肪样品,替唑尼特在0.1～25μg/kg范围内线性关系良好(r2>0.99),检测限和定量限依次为0.05μg/kg,0.1μg/kg;0.025μg/kg,0.05μg/kg;0.025μg/kg,0.05μg/kg。结果表明,该方法操作简单,灵敏度高,适用于山羊组织中替唑尼特残留量的检测。

硝唑尼特抗病毒研究进展

硝唑尼特(nitazoxanide, NTZ)是一种四氢噻唑类(thiazolidine, TZD)化合物,起初被用于治疗绦虫感染,后又被用于治疗隐孢子虫、贾第鞭毛虫、阿米巴原虫等引起的腹泻。研究偶然发现硝唑尼特可以抑制人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的复制,后续研究陆续发现硝唑尼特对多种DNA病毒和RNA病毒,包括埃博拉病毒(ebola virus, EBOV)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)等都具有显著的抗病毒活性。硝唑尼特的抗病毒机制包括通过增强固有免疫应答、影响病毒蛋白功能等机制抑制病毒复制。本文主要综述当前硝唑尼特及其代谢产物替唑尼特(tizoxanide, TIZ)抑制病毒的研究进展及可能的作用机制。