自噬相关基因在小鼠月经样模型子宫内膜崩解过程中的动态表达

目的探究小鼠子宫内膜崩解过程中自噬相关基因表达的动态变化。方法建立小鼠月经样模型,孕酮撤退后0 h、8 h、16 h和24 h分别处死小鼠取其双侧子宫组织,通过苏木素伊红(HE)染色观察小鼠子宫组织的形态特征变化,采用蛋白质印迹(WB)检测小鼠子宫内膜崩解过程中LC3B和p62蛋白的表达动态变化,实时定量PCR(RT-qPCR)检测小鼠子宫内膜崩解过程中Lc3b、p62、Beclin1、Atg3、Atg5和Atg7的mRNA水平变化。结果孕酮撤退后0 h、8 h、16 h和24 h子宫大体颜色逐渐由浅粉色变为深红色,子宫内膜崩解坏死区域逐渐扩大,24 h时蜕膜化的子宫内膜完全崩解坏死。WB结果显示:孕酮撤退后16 h时,p62的蛋白表达水平较0 h和8 h时显著升高(P<0.05),24 h时p62的蛋白表达水平较其他时间点显著升高(P<0.01);LC3B-Ⅰ蛋白在孕酮撤退后0 h到8 h无显著变化(P>0.05),8 h到24 h其表达量显著降低(P<0.05);孕酮撤退后子宫内膜崩解过程中LC3B-Ⅱ的蛋白表达水平无显著变化(P>0.05)。RT-qPCR结果显示:p62 mRNA水平在孕酮撤退后0 h到16 h无显著变化(P>0.05),而24 h时p62 mRNA水平较8 h和16 h显著降低(P<0.05);Lc3b mRNA水平在孕酮撤退后16 h时较0 h和8 h显著上调(P<0.01),而24 h时Lc3b mRNA水平显著低于撤退后16 h(P<0.01);Beclin1 mRNA水平在孕酮撤退后8 h、16 h和24 h的表达较0 h均显著下降(P<0.05),且撤退24 h后Beclin1 mRNA水平相较8 h和16 h显著降低(P<0.01);Atg3、Atg5和Atg7的mRNA水平孕在酮撤退后0 h到16 h无显著变化(P>0.05),而24 h时的mRNA水平显著低于其他时间点(P<0.05)。结论孕酮撤退后,子宫内膜崩解过程中自噬水平下降,提示自噬参与负调控子宫内膜崩解过程。

孕酮回植时间对小鼠月经样模型中子宫内膜基质细胞凋亡的影响

目的:探讨在小鼠月经样模型中孕酮回植对子宫内膜基质细胞凋亡的影响。方法:在月经模型小鼠月经发生关键时期的前后,即孕酮撤退后的12h和16h回植孕酮,24h收集小鼠子宫角,TUNEL法原位检测小鼠子宫内膜基质细胞的凋亡;Western Blotting法检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达。结果:孕酮撤退后12h回植孕酮,小鼠子宫内膜中发生凋亡的基质细胞数远低于16h回植组和对照组;而16h回植孕酮则子宫内膜基质细胞的凋亡仅仅稍低于对照组。凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,12h回植组明显高于16h回植组和对照组(P<0.01),而后两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。凋亡促进蛋白Bax和Caspase-3的表达,12h回植组均低于16h回植组和对照组(P均<0.01),而后两组之间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论:在月经发生关键时期之前,即孕酮撤退后12h回植孕酮可能通过上调Bcl-2/Bax比例而阻断Caspase-3的蛋白表达,从而有效抑制小鼠子宫内膜基质细胞的凋亡,阻断月经发生的进程,而16h回植则不能阻断小鼠月经的发生。

HIF1A与VEGF在小鼠月经样模型的表达与共定位

目的在小鼠月经模型基础上,研究低氧诱导因子(HIF1A)与血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及mRNA的表达与定位,探索HIF1A与VEGF在月经发生中可能的调控机制。方法建立小鼠月经样模型,假孕小鼠通过花生油子宫腔注射的方法诱导小鼠子宫内膜发生蜕膜化,切除卵巢致孕酮(P4)撤退以模拟月经的发生。在P4撤退后0、8、12、16、24h分别收集小鼠子宫;利用免疫组化与Western blot方法检测HIF1A、VEGF的定位与表达量,利用Real-time PCR检测二者mRNA相对表达量;分析HIF1A与VEGF的表达变化趋势与相关性。结果 P4撤退后,小鼠子宫内膜发生崩解出血,模拟月经发生。免疫组化结果显示,HIF1A蛋白在P4撤退后12、16h,内膜基质蜕膜细胞核中的表达量逐渐升高;HIF1A表达区域与VEGF表达的区域均集中在子宫内膜蜕膜化区域外周,即崩解组织与基底层交界区域。Western blot蛋白定量结果显示,细胞核中HIF1A蛋白表达量在P4撤退后8、12、16h显著增高,VEGF在细胞质中的表达量在P4撤退后0、8、12h较高。HIF1A与VEGF mRNA的表达变化趋势非常相似,即P4撤退后,逐渐升高,在12h达到峰值,随后逐渐下降。结论结果提示月经发生子宫内膜崩解中,HIF1A转录因子功能激活并调节VEGF mRNA的表达。

肿瘤坏死因子在小鼠药理性孕酮撤退月经样模型中的定位和表达

目的在药理性撤退小鼠月经样模型中,观察孕酮撤退后,肿瘤坏死因子(TNF-α)的定位和表达情况。方法卵巢切除的小鼠在诱导蜕膜化之后给予米非司酮即通过拮抗孕酮受体的方法(药理性撤退),导致孕酮撤退,并用免疫组化的方法观察米非司酮处理的不同时相,TNF-α在小鼠子宫内膜的定位;用实时PCR的方法观察TNF-α表达情况。结果免疫组化结果显示米非司酮处理后0～8 h,TNF-α主要存在于腔周围的血管内皮细胞;12～16 h,主要存在于内流的白细胞;24～48 h,主要存在于崩解组织边缘的间质细胞区域和修复好腺上皮细胞周围的间质细胞。实时PCR结果显示TNF-αmRNA在孕酮撤退后24 h内都有表达,并且TNF-α表达量逐渐增高,在12 h、16 h达到峰值。结论在此小鼠月经样模型中,米非司酮处理即孕酮撤退后TNF-α在此模型子宫中定位呈区域性分布,并诱导TNF-α表达升高,可能参与了子宫内膜的崩解。

桃仁在小鼠生理性月经样模型中对子宫内膜崩解的作用

目的:研究桃仁在小鼠生理性月经模型中的作用。方法:假孕雌鼠蜕膜化诱导后切除双侧卵巢,引发孕酮撤退,造成蜕膜化子宫内膜崩解坏死,模拟月经样出血,建立小鼠生理性月经样模型。在孕酮撤退前至孕酮撤退后24h给予模型小鼠桃仁30mg/(kg·次),观察小鼠子宫大体形态与组织形态变化。结果:孕酮撤退24h后,与对照组相比,给予桃仁的小鼠子宫颜色较深,充血明显;崩解的蜕膜化组织以及崩解组织外围的基底层,有大量红细胞渗出。而空白对照组未见此现象。桃仁处理小鼠脱膜相对崩解面积与对照组未见显著差异,而其相对充血面积高于对照组(P=0.009)。结论:桃仁能够促进小鼠月经样模型崩解期的红细胞渗出,其药理作用与作用机制有待进一步研究。

益母草碱对小鼠生理性月经样模型崩解期的作用

目的：研究益母草碱对小鼠生理性月经样模型的作用。方法：建立小鼠生理性月经样模型,将人工蜕膜化的假孕小鼠双侧卵巢切除,引发孕酮（P4）撤退,随后蜕膜化子宫内膜发生崩解坏死,模型小鼠出现月经样出血。在P4撤退前至撤退后24h,给予模型小鼠益母草碱,观察P4撤退后小鼠阴道出血状态,子宫大体形态以及组织形态学变化。结果：模型小鼠均在P4撤退后12~24h观察到阴道出血。与空白对照组相比,P4撤退后24h益母草碱药物处理组小鼠子宫颜色较深,子宫充血较显著。小鼠子宫腔上皮下的血管显著扩张,特别是腔上皮下血管扩张与红细胞渗出严重,且范围较对照组更广。通过统计学分析证实,益母草碱组充血面积高于对照组（P=0.011）。结论：提示益母草碱可导致小鼠子宫内血管扩张与红细胞渗出,其中的药理作用和分子机制有待进一步研究。

低氧和低氧诱导因子在月经样小鼠模型中对子宫内膜崩解的作用

目的探究低氧和低氧诱导因子(HIF1A)在小鼠子宫内膜崩解过程中的表达及作用。方法构建药理性小鼠月经样模型。根据月经样小鼠给药处理方式不同分为4组:(1)PW^(-)CoCl_(2)^(-)组(n=5):孕酮(P_(4))维持,不添加二氯化钴(CoCl_(2));(2)PW^(-)CoCl_(2)^(+)组(n=6):P_(4)维持,CoCl_(2)给药;(3)PW^(+)CoCl_(2)^(-)组(n=5):P_(4)撤退,不添加CoCl_(2);(4)PW^(+)CoCl_(2)^(+)组(n=6):P4撤退,CoCl_(2)给药。P4撤退后0 h、8 h、12 h、16 h、24 h处死小鼠并收集子宫组织,通过低氧探针和免疫组化检测P4撤退后不同时间点小鼠子宫低氧定位和HIF1A蛋白的表达情况;P4撤退后24 h,观察各组小鼠的子宫大体,HE染色法观察各组小鼠子宫组织形态,免疫组化染色法观察PW^(+)CoCl_(2)^(-)组和PW^(+)CoCl_(2)^(+)组小鼠子宫低氧定位和HIF1A蛋白的表达情况;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测P_(4)撤退后24 h子宫组织细胞质和细胞核中HIF1A的表达情况。结果免疫组化染色显示,小鼠子宫组织在P4撤退后低氧持续时间为0~24 h,P4撤退12 h和16 h时小鼠子宫低氧探针染色面积占比和HIF1A表达水平均显著高于P4撤退0 h时(P<0.05),低氧探针和HIF1A表达位置有很强的相关性。子宫大体和组织形态学观察显示,P4撤退后24 h,PW^(-)CoCl_(2)^(-)组和PW^(-)CoCl_(2)^(+)组小鼠子宫内膜保持完整,PW^(+)CoCl_(2)^(-)组和PW^(+)CoCl_(2)^(+)组子宫崩解出血。免疫组化染色结果显示,PW^(+)CoCl_(2)^(+)组子宫内膜的低氧染色面积占比和HIF1A核染色细胞百分比均显著高于PW^(+)CoCl_(2)^(-)组(P<0.05)。Western blot结果显示,P4撤退后24 h,PW^(-)CoCl_(2)^(-)组子宫组织细胞质HIF1A表达较高,在细胞核中几乎检测不到;与PW^(-)CoCl_(2)^(-)组相比,PW^(-)CoCl_(2)^(+)组细胞质HIF1A的表达显著降低而在细胞核中显著升高(P<0.05),PW^(+)CoCl_(2)^(-)组细胞质HIF1A的表达无显著变化而在细胞核中显著升高(P<0.05),PW^(+)CoCl_(2)^(+)组细胞质、细胞核HIF1A的表达均显著升高(P<0.05)。结论月经期间P4撤退导致子宫内膜崩解。低氧和HIF1A与月经期间子宫内膜崩解有关,但不是必需因素。

月经发生中低氧诱导因子-1A对VEGF的调节

目的在小鼠月经样模型和人蜕膜化子宫内膜基质细胞模拟月经发生基础上,探索低氧诱导因子-1A(HIF1A)对血管内皮生长因子(VEGF)的表达调控作用,以及月经发生中HIF1A对VEGF mRNA表达的调控机制。方法建立小鼠月经样模型,用ChIP方法检测HIF1A是否直接调控Vegf mRNA的表达;利用HIF1A抑制剂甲氧雌二醇(2ME)抑制HIF1A的功能,检测小鼠月经样模型中HIF1A、VEGF蛋白的表达量;人子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化并模拟月经发生,检测HIF1A与VEGF mRNA的表达;用siRNA敲降的方法抑制HIF1A,检测VEGF mRNA的表达。结果小鼠月经样模型在孕酮撤退0h,HIF1A结合的Vegf promoter的相对百分比较低,随后在8h和12h逐渐上升,在12h达到峰值(P<0.05);2ME抑制HIF1A入核的同时,抑制了VEGF的表达量(P<0.05);人蜕膜化子宫内膜基质细胞中,孕酮撤退显著上调HIF1A和VEGF mRNA的表达量(P<0.01);敲降HIF1A后,VEGF mRNA的上调受到明显的抑制(P<0.01)。结论在月经发生中,孕酮撤退能够激活HIF1A转录因子的功能,HIF1A被激活后,结合于VEGF promoter区并启动VEGF mRNA的表达。

缺血再灌注对小鼠蜕膜化子宫内膜的作用

目的以小鼠月经样模型为基础,探索缺血再灌注在月经发生中的作用。方法假孕NIH小鼠子宫诱导蜕膜化,完成蜕膜化后将小鼠分为对照组(n=8)、假手术组(n=8)与缺血再灌注组(n=10)。对照组小鼠无操作,假手术组仅实行开腹手术,而缺血再灌注组小鼠开腹后对单侧子宫角进行血管夹持手术阻断血流,30min后恢复血流,造成单侧子宫角内发生缺血再灌注,另一侧子宫角无操作。手术后观察阴道出血状况,且术后6h与24h取材进行大体观察与组织形态学观察,统计子宫内膜崩解的小鼠数量。结果处理后24h,对照组小鼠子宫内膜全部保持完好,无一例(0/8)发生内膜崩解;假手术组仅一例(1/8)发生内膜崩解;缺血再灌注组大部分小鼠(8/10)双侧子宫角的子宫内膜均发生崩解并伴随阴道出血现象。结论缺血再灌注能够直接导致绝大部分小鼠蜕膜化子宫内膜发生完全崩解。