MAD1在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨MAD1在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法选取100例乳腺癌患者石蜡标本,实施癌组织和癌旁组织切片,应用免疫组化法检测MAD1表达。分析MAD1表达与患者预后及肿瘤生物学行为的关系。结果在乳腺癌组织中,MAD1蛋白的血管内皮细胞和癌细胞表达,少量定位于细胞核,主要定位在患者的血管内皮细胞的细胞质和癌细胞。阳性显影为棕黄色沉积。在正常乳腺的上皮,MAD1表达为强阳性,乳腺导管内癌的表达稍弱;100例患者中共获得有效随访100例,随访率为100.00%。其中患者的1年生存率为97.00%,高于2年的87.00%、3年的80.00%(P<0.05)。MAD1表达差异分析显示,HER-2高表达同低表达患者比较有差异(P<0.05)。随着组织学分级的增高,MAD1蛋白高表达率有降低趋势,但差异不显著(P>0.05)。MAD1的表达在乳腺癌组织中强,其和乳腺癌的预后关系密切。乳腺癌患者MAD1和临床分期、淋巴结是否转移存在相关性,出院后患者生存时间为1个月至3年。MAD1表达水平和患者的生存时间呈现相关性。结论MAD1是判断乳腺癌患者预后的关键分子标志物,其高表达显示出乳腺癌患者有较好的长期生存和疾病预后。

有丝分裂阻滞缺陷蛋白2选择性剪接体MAD2β在胃癌细胞多药耐药机制中的作用

目的 观察有丝分裂阻滞缺陷蛋白 2 (mitoticarrestdeficientprotein 2 ,MAD2 )基因的选择性剪接体MAD2 β在人胃癌多药耐药性形成过程中的作用机制。 方法 从耐阿霉素人胃癌细胞系SGC790 1/ADR中提取总RNA ,通过RT PCR获得MAD2 β全长编码cDNA ,并克隆至pUCm T载体 ,正向亚克隆插入真核表达载体pcDNA3.1中。以脂质体介导pcDNA3.1/MAD2 β真核表达载体转染胃腺癌细胞SGC790 1。以体外药敏试验检测转染MAD2 β的胃癌细胞及其对照组细胞对化疗药物的敏感性。通过流式细胞仪检测MAD2 β基因转染组和对照组胃癌细胞在细胞周期中的分布和细胞内阿霉素的荧光强度。结果 RT PCR扩增获得约 0 .5 3kb片段 ,DNA序列测定证实为MAD2的一种选择性剪接形式 ,命名为MAD2 β。重组正义真核表达载体pcDNA3.1/MAD2 β瞬时转染SGC790 1细胞 ,经MTT法证实 ,转染细胞SGC790 1/MAD2 β对化疗药物阿霉素、长春新碱和丝裂霉素的耐药性增强。与SGC790 1/pcDNA3.1比较 ,阿霉素大剂量短期作用后 ,SGC790 1/MAD2 β细胞内的平均荧光强度比对照组低 (P <0 .0 5 )。结论 MAD2 β基因在一定程度上增强了人亲本胃癌细胞SGC790 1对化疗药物的耐受性 ,其可能的机制为肿瘤细胞在化疗药物作用下 ,有丝分裂出现异常 ,耐药细胞通过调控MAD2?

HeLa/GFP-Plk1/Cherry-H2B稳定细胞系的构建

目的:构建可研究Polo样激酶1(Plk1)定位的HeLa细胞系。方法:用PCR方法扩增Plk1基因,定向克隆到pRex-EGFP-IRES-Hygro载体中,构建pRex-EGFP-Plk1-IRES-Hygro表达载体;利用逆转录病毒感染的方法,向HeLa细胞系中依次转染pRex-EGFP-Plk1-IRES-Hygro、pRex-Cherry-H2B-IRES-Hygro,构建Hela/GFP-Plk1/Cherry-H2B稳定细胞系;激光共聚焦显微镜观察Hela/GFP-Plk1/Cherry-H2B稳定细胞系在不同有丝细胞分裂期时Plk1的定位。结果:质粒酶切及测序证明pRex-EGFP-Plk1-IRES-Hygro载体构建正确;在Hela/GFP-Plk1/Cherry-H2B稳定细胞系有丝分裂中期和末期时,观察到Plk1分别定位于着丝粒和中间体上。结论:构建了Hela/GFP-Plk1/CherryH2B稳定细胞系,为研究Plk1在有丝分裂不同时期的调控机制提供了细胞模型。

子宫内膜癌组织中Mad2和Mtp53蛋白的表达变化及意义

目的观察子宫内膜癌组织中有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(Mad2)和突变型p53(Mtp53)蛋白表达变化。方法采用免疫组化SP法检测30例正常子宫内膜(A组)、30例复杂型增生子宫内膜(B组)和63例子宫内膜癌组织(C组)中的Mad2和Mtp53蛋白。结果 A、B、C组Mad2蛋白的阳性率分别为23.33%、56.67%、85.71%,Mtp53蛋白的阳性率分别为0、26.67%、69.84%,组间比较P均<0.05。Mad2蛋白阳性率与子宫内膜癌的分化程度相关,P<0.05;与临床分期和淋巴结转移无关(P均>0.05)。Mtp53蛋白阳性率与内膜癌临床分期、淋巴结转移及分化程度均相关(P均<0.05)。二者在子宫内膜癌组织中表达呈正相关(r=0.547,P<0.001)。结论子宫内膜癌组织中Mad2和Mtp53表达升高。检测子宫内膜癌组织中的Mad2和Mtp53有助于估计患者病情和预测预后。

纺锤体检验点蛋白在卵母细胞减数分裂过程中的研究进展

纺锤体组装检验点蛋白在卵母细胞减数分裂中发挥着重要作用。它可以看作是一个高保真的监控染色体准确分离的系统,延缓分裂中期向后期的转变,直到所有的染色体准确排列到赤道板上。而在纺锤体组装检验点研究中,最重要的是各个纺锤体检验点蛋白对减数分裂的调控机制。如果纺锤体检验点蛋白异常或发生突变,可能会产生染色体数目或形态不正常的细胞。本文对参与减数分裂过程中重要的纺锤体检验点蛋白的定位及功能进行综述。

MAD2L1在肺癌中表达的研究进展

肺癌发病率和死亡率居恶性肿瘤的前列,靶向治疗和免疫治疗在肺癌的治疗中取得了不错的疗效,但是获益人群仍然有限,所以,亟需探索更多的分子靶点及预后标志物来提高肺癌患者的治疗效果和生存率。目前多项研究表明有丝分裂阻滞缺陷2样蛋白1(MAD2L1)在肺癌中高表达,可能成为肺癌患者的不良预后标志物及潜在治疗靶点。本文作者通过对MAD2L1的通路表达以及在肺癌中的表达情况和肿瘤微环境之间的关系进行综述,进一步探讨MAD2L1是否可作为肺癌相关的新型生物标志物,以期为肺癌的治疗提供新的依据。

MAD2 RNA干扰载体的构建及其对胃癌细胞生长的影响

目的构建MAD2(有丝分裂阻滞缺陷蛋白2)特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制MAD2基因表达对胃癌细胞生长和细胞周期的影响。方法构建MAD2siRNA真核表达载体,脂质体法将pSilencer3.1空载体和pSilencer3.1/MAD2-siRNA1和pSilencer3.1/MAD2-siRNA2真核表达载体分别导入人胃癌细胞系SGC7901。稳定转染后Westernblot和RT-PCR检测胃癌细胞内MAD2蛋白及mRNA水平的表达情况,挑选出抑制效果最好的单个克隆。MTT法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测纺锤体抑制剂长春新碱作用后,胃癌细胞MAD2-siRNA转染组和空载体组细胞周期的分布。结果成功构建MAD2siRNA真核表达载体,转染胃癌细胞SGC7901可使其MAD2蛋白及mRNA表达显著下调。MAD2表达降低的胃癌细胞生长速度明显增快(P<0.01),经长春新碱作用后不能被阻滞于有丝分裂期。结论小干扰RNA技术可以有效地特异性抑制胃癌细胞纺锤体检查点关键蛋白MAD2的表达。MAD2的抑制可使胃癌细胞SGC7901生长加速,增殖能力增强,同时减弱纺锤体抑制剂长春新碱阻滞细胞周期的作用。

人剪切修复基因XPD肝癌对人HepG2细胞中Rb和MAD2表达的影响

目的:探讨人剪切修复基因着色性干皮病D组基因(xeroderma pigmentosum group D,XPD)转染人肝癌HepG2细胞后视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma,Rb)和有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest deficient 2,MAD2)表达的变化及对细胞增殖的影响。方法:将人工合成的pEGFP-N2-XPD重组质粒通过LipofectamineTM2000转染HepG2细胞。实验分为4组,分别为无转染HepG2细胞组(空白对照组)、脂质体转染HepG2细胞组(脂质体组)、空载质粒pEGFP-N2转染细胞组(N2组)和重组质粒pEGFP-N2-XPD转染细胞组(XPD组)。分别用RT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中XPD、Rb及MAD2 mRNA和蛋白的表达量,用MTT法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组的细胞凋亡情况及细胞周期。结果:与其它3组相比,XPD组XPD mRNA及蛋白表达量明显升高(P<0.05),Rb mRNA及蛋白表达量明显升高(P<0.05),而MAD2 mRNA及蛋白表达量显著降低(P<0.05)。XPD组细胞增殖活力显著降低,细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。XPD组细胞停滞在G1期,难以进入S期。结论:XPD可以抑制MAD2的表达和肝癌细胞的增殖,促进Rb的表达。

上调的细胞周期相关蛋白在胃癌中的作用研究

目的进一步研究胃癌发病机制。方法富集分析3个GEO数据集筛选出的差异基因,利用STRING数据库绘制蛋白质相互作用图,使用Cytoscape软件筛选关键基因。通过TCGA数据库验证关键基因的差异表达。利用Western blotting和实时荧光定量PCR(qPCR)检测胃癌组织中细胞周期相关基因的蛋白和mRNA的表达水平。结果共筛选出203个差异表达基因,其中包括131个上调表达和72个下调表达基因。与癌旁组织相比,周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、细胞周期蛋白B1(CCNB1)和有丝分裂停滞缺陷蛋白2(MAD2L1)在胃癌组织中明显上调表达(P<0.05)。在胃癌组织中,CCNB1和CDK1之间存在显著正相关关系(R=0.98,P<0.001)。Western blotting和qPCR结果显示,胃癌组织中CDK1、CCNB1和MAD2L1的蛋白和mRNA水平均上调表达(P<0.05)。结论CDK1、CCNB1和MAD2L1在胃癌组织中上调表达,有可能成为治疗胃癌的新的潜在生物标志物。

EGFP-MAD2融合基因表达载体的构建及功能验证

目的:构建绿色荧光蛋白(EGFP)与有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2)融合基因表达载体,并初步验证融合基因的功能。方法:采用PCR技术扩增EGFP-MAD2融合基因,连接入T载体进行序列测定,随后克隆入逆转录表达载体p QCXIP-EGFP-N1获得重组质粒,采用脂质体转染293FT细胞,荧光显微镜观察融合蛋白的表达,流式细胞仪分析细胞周期。结果:获得序列正确的EGFP-MAD2融合基因及其表达载体p QCXIP-EGFP-MAD2;EGFP-MAD2基因可在293FT细胞中表达;流式分析显示EGFP-MAD2表达的细胞G2/M期比例增加。结论:构建了EGFP-MAD2融合基因表达载体,EGFP-MAD2融合蛋白的表达可以诱导细胞发生G2/M期阻滞。

HIV-1 Vpr蛋白对小鼠神经瘤母细胞N2a活性及细胞周期的影响

目的探讨HIV-1 Vpr蛋白对小鼠神经细胞的毒性作用。方法巢式PCR扩增了1例HIV相关痴呆(HIV associated dementia,HAD)和1例非HAD的艾滋病患者脾(spleen,SPL)、脑膜(meninges,MG)共4个部位的HIV-1 vpr基因测序,对基因序列和氨基酸位点进行分析。构建pEGFP-N1-vpr真核表达载体,脂质体法转染N2a细胞,Western blot检测Vpr蛋白在N2a细胞中的表达,流式细胞术研究了不同来源的Vpr蛋白对N2a细胞活性和细胞周期的影响。结果PCR扩增出HIV-1 vpr基因,序列分析显示vpr基因序列属于HIV-1B亚型,HAD和非HAD患者中枢来源的Vpr蛋白在C末端84、86和87位存在氨基酸位点的突变;Vpr蛋白可抑制神经细胞活性,导致G2周期阻滞,不同来源的Vpr作用存在差异,HAD患者MG来源的Vpr蛋白,表现出更强的抑制细胞活性和G2周期阻滞能力。结论Vpr蛋白关键氨基酸位点的变异可致其生物学功能的明显改变,其在HAD发病机制中的意义仍待进一步研究。

干扰MAD2L1基因表达对乳腺癌细胞凋亡的影响及机制

目的探讨干扰有丝分裂阻滞缺陷2样蛋白1(MAD2L1)基因表达对乳腺癌(BC)细胞凋亡的影响及其机制。方法采用qRT-PCR检测正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和4种BC细胞系(MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3和BT-20)中MAD2L1 mRNA表达水平。将MAD2L1 siRNA转染至MDA-MB-231细胞中,qRT-PCR和Western blotting检测细胞中MAD2L1 mRNA和蛋白表达水平;MTT检测细胞增殖能力;流式细胞术法检测细胞凋亡率;Western blotting检测细胞中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3、p-p38MAPK(Thr180/Thr182)和p38MAPK等蛋白表达水平。采用p38MAPK抑制剂SB203580联合处理上述细胞,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率的变化;Western blotting检测Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3、p-p38MAPK和p38MAPK表达水平的变化。结果BC细胞系中MAD2L1 mRNA表达水平高于MCF-10A细胞,其中MDA-MB-231细胞最为显著。干扰MAD2L1基因可降低MDA-MB-231细胞中MAD2L1 mRNA和蛋白表达水平(t_(mRNA)=10.51,P_(mRNA)<0.001;t_(蛋白)=18.30,P_(蛋白)<0.001),同时抑制细胞增殖(F_(组别)=243.36、F_(时间)=44.00、F_(组别×时间)=9.881,P均<0.001),促进细胞凋亡(t=9.10,P<0.001),并上调Bax、cleaved-caspase-3和p-p38MAPK蛋白表达水平(t_(Bax)=15.05,P_(Bax)<0.001;t_(cleaved-caspase-3)=5.26,P_(cleaved-caspase-3)=0.006;t_(p-p38MAPK)=28.46,P_(p-p38MAPK)<0.001),下调Bcl-2蛋白表达水平(t_(Bcl-2)=14.23,P<0.001)。然而,SB203580处理可抑制MAD2L1基因干扰对MDA-MB-231细胞凋亡的诱导作用(P=0.002)。结论干扰MAD2L1基因表达可抑制MDA-MB-231细胞增殖,并诱导其凋亡,其作用机制可能与激活p38MAPK信号通路有关。

喉鳞状细胞癌中MAD2的表达及临床意义

目的探讨喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中有丝分裂阻滞缺陷蛋白(MAD2)的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学EliVision二步法检测55例LSCC组织、30例癌旁正常黏膜组织中MAD2蛋白的表达并分析其与LSCC临床病理特征的关系。结果 MAD2蛋白在LSCC组织中的阳性表达率为58.2%(32/55),低于癌旁正常黏膜组织86.7%(26/30),两者差异有统计学意义(P<0.01);中、低分化组MAD2阳性表达率为47.1%(16/34),低于高分化组76.2%(16/21),淋巴结转移组MAD2阳性表达率为35.0%(7/20),低于无淋巴结转移组71.4%(25/35),两组差异均有统计学意义(P均<0.05);MAD2阳性表达与患者性别、年龄、吸烟、肿瘤原发部位、T分期及临床分期无相关性(P均>0.05)。结论 MAD2蛋白在LSCC的发生、分化及转移中可起重要作用,可作为LSCC诊断及预后的参考指标之一。

氯化锂对卵巢癌细胞增殖凋亡影响及其机制探讨

目的:观察氯化锂(lithium chloride,LiCl)对卵巢癌SKOV3细胞增殖活性及凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:使用20(A组)、40(B组)和60(C组)mmol/L LiCl处理SKOV3细胞,正常对照组用等体积的细胞培养基培养。采用CCK8法观察LiCl对卵巢癌SKOV3细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测LiCl作用后细胞周期变化及凋亡情况。蛋白质印迹法检测细胞糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase3β,GSK-3β)、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(phosphorglation-glycogen synthase kinase3β,p-GSK-3β)及有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest deficient2,MAD2)蛋白表达的变化。结果:不同浓度LiCl分别作用于SKOV3细胞48h后,A组细胞增殖活性为(80.64±1.06)%,与B组(57.18±1.56)%比较,差异有统计学意义,P=0.001;与C组(43.18±6.12)%比较,差异有统计学意义,P<0.001。B组作用24h细胞增殖活性为(75.12±9.35)%,48h为(57.18±1.56)%,72h为(35.36±1.00)%,与24h组相比,48h组(P=0.158)和72h组(P=0.036)细胞增殖活性降低。LiCl能有效抑制SKOV3细胞增殖,呈时间与剂量依赖性。不同浓度LiCl作用96h后SKOV3细胞的凋亡率相对于对照组升高,A组为(7.82±0.87)%,P=0.037;B组为(21.09±1.57)%,P<0.001;C组为(27.83±0.47)%,P<0.001,差异均有统计学意义。不同浓度LiCl作用48h后,细胞出现了明显的G2/M期阻滞,G2/M期的比例由对照组的(10.23±1.50)%依次升高,A组为(19.9±4.16)%,P=0.352;B组为(30.29±0.51)%,P=0.045;C组为(39.32±1.11)%,P=0.009,差异有统计学意义。蛋白质印迹法检测结果显示,LiCl浓度升高,p-GSK-3β蛋白相对表达量升高,A组为(54.39±2.75)%,P=0.019;B组为(72.39±2.89)%,P=0.009;C组为(86.57±2.52)%,P=0.005,差异有统计学意义。LiCl浓度升高,MAD2蛋白相对表达量升高,A组为(52.29±1.34)%,P=0.041;B组为(58.35±1.36)%,P=0.030;C组为(72.07±2.93)%,P=0.006,差异有统计学意义。结论:LiCl能有效抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖,并诱导其凋亡;上调MAD2增强有丝分裂检测点功能,最终导致细胞G2/M期阻滞可能是LiCl抑制增殖促进凋亡的机制。