慢病毒携带人Galectin-3基因RNAi的有效靶点筛选

目的构建携带人Galectin-3基因的RNAi慢病毒载体,测定感染滴度,并对不同靶点进行有效筛选。方法根据Galectin-3基因设计4对,经退火制备的双链DNA oligo,连接经双酶切的线性化pGCL-GFP/U6载体,转化后经PCR鉴定,阳性克隆测序,质粒抽提,经CaCl2导入293T细胞,包装成慢病毒,收集病毒上清并检测其滴度。将含Galectin-3基因的RNAi病毒颗粒,感染靶细胞,荧光显微镜观察细胞荧光,感染率>50%时,收集细胞抽提RNA,RT-PCR检测Galectin-3mRNA水平,评价干扰效果。结果经测序、PCR分析证实目的序列成功连接到载体上,载体构建成功,包装成高滴度慢病毒。感染MCF-7细胞系后,细胞荧光显示感染率>50%,定量RT-PCR检测结果发现:1#和3#靶点敲减Galectin-3基因效率达95%、85%。结论成功构建并筛选了携带有人Galectin-3基因的RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步研究Galectin-3在肿瘤细胞中的作用提供实验平台。