有机磷水解酶异源表达纯化及抗乙基对氧磷中毒能力初步评价

目的异源表达纯化有机磷水解酶(OPH),初步评价其动物体内抗乙基对氧磷中毒能力。方法构建OPH的大肠杆菌表达菌株,采用镍柱亲和色谱及凝胶过滤色谱进行纯化,对纯化产物进行蛋白质谱鉴定;以乙基对氧磷为底物测定酶活力及其动力学常数K_(m),V_(max),k_(cat)和k_(cat)/K_(m);12只SD大鼠随机分为OPH组和溶剂对照组,OPH组按1 mg·kg^(-1)剂量iv给予OPH溶液,对照组给予等体积生理盐水,给药后2组立刻sc给予2倍半数致死量(LD_(50))乙基对氧磷(0.86 mg·kg^(-1))染毒,观察大鼠状态,对中毒症状进行评分。对存活大鼠每隔24 h重复sc给予2倍LD_(50)乙基对氧磷,根据大鼠存活情况与中毒症状分别绘制生存曲线与症状评分图,评价OPH的抗有机磷中毒能力。结果成功构建了OPH的大肠杆菌表达菌株,经过两步纯化后由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳表征得单一条带,OPH纯度较高,经蛋白质谱测定制备蛋白与目标蛋白序列一致;以乙基对氧磷为底物时,OPH的Km=7.5×10^(-5)mol·L^(-1),V_(max)=2.2×10^(-7)mol·L^(-1)·s^(-1),k_(cat)=158.4 s^(-1),k_(cat)/K_(m)=2.1×10^(6) L·mol^(-1)·s^(-1);对照组大鼠sc给予2倍LD_(50)乙基对氧磷后,出现严重中毒症状,15 min内全部死亡,实验组大鼠在首次染毒后均未出现中毒症状,连续染毒后中毒症状逐渐加重直至第4天全部死亡。结论成功制备高纯度OPH,且OPH在大鼠体内能有效对抗乙基对氧磷中毒。

细胞表面展示有机磷水解酶的恶臭假单胞菌工程菌的构建及全细胞酶活性分析

利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)冰核基因的N-末端(inpn)作为锚定单元(anchoring mo-tif),通过与来自黄杆菌属(Flavobacteriumsp.)的有机磷水解酶基因opd构建融合基因inpn-opd,并连接于假单胞菌表达载体pYMBP,然后导入恶臭假单胞菌(P.putida)野生型菌株AB92019,获得了能在其细胞表面展示有机磷水解酶并具有全细胞酶催化活性的重组工程菌MMBL-opd。SDS-PAGE结果表明,融合基因能表达产生80 ku的蛋白质。重组菌MMBL-opd在无抗性LB固体培养基上能稳定生长,所携带的外源质粒的稳定性达到100%;在添加100μmol/L Co2+培养基上28℃培养48 h,表面展示的有机磷水解酶具有最高全细胞酶活性,为0.036 U/mg。用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低92%。重组菌在PBS缓冲液中于4℃条件下保存30 d,仍能保持93%的全细胞酶活。

有机磷水解酶的大肠杆菌细胞表面展示与酶活特性

利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)KCTC1832菌株的冰核蛋白(InaK)的N-末端作为锚定单元和来自黄杆菌(Flavobacterium sp.)ATCC27551菌株opd基因编码的有机磷水解酶作为功能蛋白,构建了一株具有全细胞催化效应的大肠杆菌(Escherichia coli)表面展示工程菌MMBL-405.对该工程菌全细胞有机磷水解酶活性的正交试验结果表明,在诱导物IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导温度为20℃、诱导时间为8 h和Co2+添加浓度为100μmol/L的优化培养条件下,其全细胞酶活性可达到0.62 U/mg细胞干重,是目前国外同类工作所报道酶活性的13.7倍以上.对工程菌所携带的外源质粒在无抗性条件下的稳定性进行了测定,结果表明工程菌经连续转接7次和继代培养168 h后,质粒携载率仍达到60%.

有机磷水解酶及其在传感器应用中的研究进展

有机磷农药的大规模使用对环境造成了严重污染,同时由于其残留严重威胁着人类健康。有机磷水解酶是一种广泛存在于生物体内的可以催化各种有机磷化合物水解的酶。利用有机磷水解酶制成的生物传感器能够有效检测有机磷农药的残留。文章分别从有机磷水解酶的结构、重组表达以及在生物传感器应用等方面进行了综述,旨在为有机磷农药的检测和降解提供参考。

pH型有机磷水解酶生物传感器的稳态模型

从分析pH型有机磷水解酶(OPH)生物传感器(简称OPH-pH型传感器)的工作原理出发,建立了描述稳态检测过程的扩散传质方程组,并根据方程组的特点将二阶微分方程组简化为二阶微分方程和非线性方程的求解,从而建立了OPH-pH型传感器的稳态模型。模型的计算结果给出了传感器性能的影响因素,可对传感器的设计提供一定的理论指导,自行制备的传感器实验结果与模型的计算结果基本吻合,验证了模型的正确性。

转基因表达有机磷水解酶(OPH)提高黄瓜降解蝇毒磷能力的初步研究

为快速提高黄瓜降解有机磷农药残留的能力，选取能广泛降解有机磷农药的有机磷水解酶（OPH）为表达蛋白，构建CaMV35S启动子驱动有机磷水解酶基因（opd）的植物表达载体pSOP，经双酶切证明重组载体含有插入位置和方向皆正确的目的片段。通过农杆菌介导遗传转化黄瓜子叶节，诱导和筛选出9株抗性苗，获得3株GUS染色和PCR阳性转化苗。酶活性分析表明，转基因黄瓜降解蝇毒磷能力是对照（非转基因株）的4．7～9．7倍，最高达到7．8μmol／（mg·min），有助于加快降解黄瓜中的有机磷农药残留，为食品安全研究提供借鉴。

有机磷水解酶传感器及其应用研究进展

介绍了有机磷水解酶传感器的基本原理、组成和分类,分析了各个类型传感器的特点,重点介绍了近年来国外有机磷水解酶的固定化技术和有机磷水解酶传感器的进展情况,并分析了未来有机磷水解酶传感器的发展趋势。

有机磷水解酶及其细胞表面展示研究进展

对有机磷水解酶在酶学特性、蛋白结构和细胞表面展示等方面的研究进行了综述,并且对该领域的研究趋势进行了展望。

番茄果实特异性表达有机磷水解酶的农药降解活性分析

为研究番茄果实中表达有机磷水解酶(OPH)降解有机磷农药的活性,经农杆菌介导,将携带表达元件E8-OPD的植物表达载体pSE8OP遗传转化番茄子叶,通过抗性筛选和分子检测,获得6株GUS染色和PCR扩增阳性的转基因番茄植株。酶活分析发现,酶促反应最适温度为30℃,稳定性较高。酶的最适保存pH值为9,最适试验pH值为8.0。与1 mmol/L Zn2+条件下酶活相比,Co2+提高了酶活2.1倍,Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、EDTA、SDS、TritonX-100、β-ME和DTT都不同程度地抑制了酶活。检测重组表达OPH降解蝇毒磷、毒死蜱和对硫磷的酶活。表明,降解蝇毒磷的Km最低,为4.04μmol/L。重组表达OPH有助于提高番茄果实降解有机磷农药残留的能力。

重组有机磷水解酶的研究进展

有机磷水解酶 (OPH)是处理有机磷杀虫剂和化学战剂污染最有前途的酶。大规模使用需要进行重组。目前的研究主要集中于提高重组有机磷水解酶的表达水平、活性及稳定性。对其在化学防护与洗消、临床和有机磷生物探测器等方面的应用也有研究。

有机磷水解酶的表面显示技术研究进展

有机磷化合物在农业中的广泛应用,给农作物带来增产的同时对环境造成污染,严重威胁着人类的健康,其生物解毒已受到高度重视。有机磷水解酶(OPH)是目前处理有机磷化合物最有效的水解酶类,而通过基因工程手段获得高表达、高降解效率的OPH,尤其是OPH的表面显示技术是近年来的研究热点。主要综述了大肠杆菌、假单胞菌、酿酒酵母的OPH表面显示技术研究及应用进展和发展趋势。

有机磷水解酶全细胞生物催化剂的特性

利用有机磷水解酶大肠杆菌细胞表面展示工程菌为全细胞催化剂,研究了其降解对氧磷的反应.确定了最适反应条件为:反应温度37℃、pH值8.0、底物浓度2.0 mmol/L、振荡速率120 r/min,在此条件下反应5 h,对氧磷降解率可达80%左右,且全细胞催化剂具有较好的稳定性和可重复使用性,显示了良好的应用前景.

基于响应面分析方法的有机磷水解酶全细胞活性表达条件的优化

为了提高有机磷水解酶(OPH)全细胞活性,对其表达条件进行了优化。首先采用Plackett-Burman试验设计对8个影响因素进行筛选,结果表明,诱导时间、IPTG浓度和诱导温度3个因素对OPH全细胞活性影响较大。在此基础上采用Box-Behnken设计,利用Design Expert软件进行二次回归分析,得到该基因工程菌的最佳表达条件为诱导温度18.86℃,IPTG浓度0.09mmol/L,诱导时间8.74h。OPH全细胞活性的最大预测值为27.829U/mL,试验验证值为27.8U/mL。

细胞表面展示有机磷水解酶的研究概况

近年来,有机磷水解酶越来越多地被展示到不同的细胞表面。对有机磷水解酶的细胞表面展示技术的原理,大肠杆菌、假单胞菌、酵母菌等几种细胞表面展示有机磷水解酶系统的研究概况进行综述。

有机磷水解酶对不同有机磷农药降解功效的评价

通过2种检测方法测定了有机磷水解酶对不同有机磷农药的降解功效,一种方法是通过气相色谱法直接检测降解产物中农药的残留量来评价有机磷水解酶对不同农药的降解功效;另一种方法是利用有机磷类农药可以抑制乙酰胆碱酯酶的活性,受抑制的胆碱酯酶不能将靛酚乙酸酯(红色)分解为靛酚(蓝色)和乙酸的原理,通过测定有机磷水解酶降解后有机磷农药的残留量对胆碱酯酶的抑制作用来评价有机磷水解酶对不同有机磷农药的降解功效。研究结果发现:有机磷水解酶对甲基对硫磷、对硫磷、喹硫磷和敌敌畏具有高效降解作用,降解率在82.2%～98.7%;其次是氧乐果、久效磷和敌百虫,降解效率在28.1%～45.4%;其他的降解效率均在20%以下。

有机磷水解酶生物传感器载体固定化酶的研究

有机磷水解酶(OPH)传感器作为检测农产品中农药残留的新型检测装置,其酶的固定化对OPH传感器的灵敏度和稳定性有重要的影响。研究了几种酶固定化载体、孔径大小、固定方式、固定方法(试剂组成)对传感器pH值的影响。结果显示:采用孔径为0.45μm的硝酸纤维素膜制备固定化酶片的pH值要大于其余几种;采用浸泡方式制备固定化酶片的pH值明显大于传统的滴定法;采用牛血清白蛋白(BSA)、戊二醛交联固定的效果优于酶直接吸附法和BSA固定法,且当戊二醛体积分数为2.5%,BSA为10%时,酶固定化效果最好。

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测

甲基对硫磷是一种毒性较强的有机磷农药,常被用作菜农用作杀虫剂,有机磷水解酶可通过切断甲基对硫磷中的P=0键实现对甲基对硫磷的快速、高效降解。通过对有机磷水解酶降解条件进行优化,得到有机磷水解酶最优的农药降解条件:酶浓度为1∶1 000、pH值为8、降解温度为37℃、降解时间为10 min。通过气相色谱法测得有机磷水解酶对1、5、10μg/mL甲基对硫磷的降解率均达到98%以上,因此在生产中有机磷水解酶可作为针对甲基对硫磷的高效快速降解酶进行推广使用。

优化合成有机磷水解酶opd p基因在毕赤酵母中的表达

拟验证通过密码子优化有机磷水解酶(opd)基因,和生物砖方法构建opd多拷贝载体,以提高在毕赤酵母中的表达量.将原始的opd基因依照毕赤酵母偏爱密码子设计合成新的有机磷水解酶基因,并在C端添加了6个His-Tag融合蛋白标签.所合成的opd p基因全长1 149 bp(base pair).基因克隆入p HBM905BDM毕赤酵母表达型质粒,成功构建重组表达质粒p HBM905BDM-opd p,以及多拷贝表达质粒p HBM905BDM-opd p-2C,p HBM905BDM-opd p-3C,p HBM905BDMopd p-4C,转化毕赤酵母感受态细胞GS115.实验结果表明,经甲醇诱导后,在AOX1(乙醇氧化酶基因)启动子调控下,获得OPD P蛋白分泌表达,Western Blot检测4个转化的菌株中都表达了目的蛋白,且两拷贝表达量较一拷贝有提高,达到0.2 U/m L.但是随着拷贝数的进一步增加表达量呈现下降的趋势.

有机磷水解酶纳米胶囊的调控及其对酶活性和稳定性的影响

纳米胶囊化是提高有机磷水解酶(organic phosphorus hydrolase,OPH)稳定性,进而实现其实用化的最具前景的解决方案。纳米胶囊一方面能够有效保护有机磷水解酶免于失活,但另一方面胶囊的存在也会阻碍底物与酶活性中心的接近。因此,通过调节纳米胶囊的结构来调控有机磷水解酶纳米胶囊活性和稳定性是十分值得研究的课题。本文用N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯(N-succinimidyl acrylate,NAS)将有机磷水解酶表面丙烯酰化,以丙烯酰胺(acrylamide,AAM)和N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride,APM)为单体,在有机磷水解酶蛋白表面进行原位自由基聚合反应,制备了单分散的有机磷水解酶纳米胶囊(OPH nanocapsule,nOPH)。用透射电镜和傅里叶红外光谱对nOPH结构进行了表征。研究了不同NAS投料量在37℃下对有机磷水解酶纳米胶囊活性,及其热稳定性和有机溶剂稳定性的影响规律。当NAS投料量在75∶1以下时,纳米胶囊的存在对有机磷水解酶活性未见影响,而当大于这一投料比时,酶活性会因胶囊致密程度的上升而下降。在加热下或有机溶剂中,有机磷水解酶纳米胶囊的酶活性呈现出随着NAS投料比的增加先增加而后下降的趋势。以上结果表明,酶活性可以通过在由有机磷水解酶制得有机磷水解酶纳米胶囊的过程中,调节纳米胶囊至合适的致密程度来最大程度的保留。合适的致密程度还能显著提高有机磷水解酶纳米胶囊热稳定性和有机溶剂稳定性。这对进一步实现有机磷水解酶的实用化具有重要意义。

枯草芽孢杆菌分泌表达有机磷水解酶突变体和降解沙林活性的研究

有机磷水解酶是一种能够有效水解有机磷酸酯类化合物的酯酶,天然含有机磷水解酶的生物体中分离的有机磷水解酶存在水解速率较慢、产量低、提纯复杂等问题。本文通过枯草芽孢杆菌分泌表达有机磷水解酶,提高有机磷水解酶产量。同时对有机磷水解酶基因进行点突变,构建了H254R-H257Y-L303T三位点联合突变的突变体,用联苯胺定量法比较野生型和突变体水解神经性毒剂沙林的能力。结果表明,该枯草芽孢杆菌表达体系能够稳定分泌表达有机磷水解酶,野生型有机磷水解酶水解沙林的活性为0.407 mg/(min·mg),含有突变体的活性为0.790 mg/(min·mg),较野生型有机磷水解酶提升了94.1%,水解能力显著增强。通过BIOVIA软件模拟有机磷水解酶结构,发现突变体稳定性优于野生型有机磷水解酶。本枯草芽孢杆菌表达体系能够稳定分泌表达有机磷水解酶,具有较好的生物活性,突变体比野生型有机磷水解酶结构更加稳定,水解能力得到了提升,是一个比较理想的突变方向。