基于肾脏类器官研究镁离子减轻顺铂诱导的急性肾损伤的作用和机制

目的利用肾脏类器官和HK-2细胞研究镁离子(Mg2+)对顺铂诱导的急性肾损伤(cisplatin-induced acute kidney injury,Cis-AKI)的作用,并探究可能的机制。方法首先利用人源性诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)构建肾脏类器官,在此基础上构建Cis-AKI模型,利用HE染色观察肾脏类器官结构,通过免疫荧光染色观察标志物定位及cleaved caspase-3表达,通过qRT-PCR检测肾小管和肾小球标志物及炎症因子mRNA水平。随后将肾脏类器官及HK-2细胞随机分为对照组、顺铂组(Cis组)和Mg2+预处理组(Cis+Mg2+组)。通过CCK-8和ATP含量评估肾小管上皮细胞的活力;利用TUNEL染色检测肾小管上皮细胞凋亡情况;通过Western blot检测细胞凋亡通路的关键蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及有机阳离子转运体2(organic cation transporter 2,OCT2)表达;通过免疫荧光检测OCT2的定位与表达。结果肾脏类器官培养第10天的肾小管结构清晰,肾脏标志物大量表达;10μmol/L顺铂导致肾脏类器官结构破坏,cleaved caspase-3表达量和炎症因子mRNA水平显著升高,ATP含量显著下降。与Cis组相比,Cis+Mg2+组肾脏类器官ATP含量升高,TUNEL阳性细胞数减少,细胞凋亡相关蛋白表达显著下降,OCT2表达显著下降;而Cis+Mg2+组HK-2细胞活力、TUNEL阳性细胞数及凋亡相关蛋白均无明显改善,且几乎不表达OCT2。结论肾脏类器官是研究Cis-AKI发病与治疗的理想体外模型;Mg2+预处理可显著减轻顺铂所致肾脏类器官的损伤,其机制可能与OCT2的下调有关。

七氟烷对肺动脉高压大鼠右心室重构时心肌细胞Ca^(2+)转运蛋白表达的影响

目的评价七氟烷对肺动脉高压大鼠右心室重构时心肌细胞Ca^(2+)转运蛋白表达的影响。方法清洁级健康成年雄性SD大鼠24只,8~10周龄,体质量200~250 g,采用随机数字表法分为4组(n=6):对照组(CM组)、七氟烷组(CS组)、野百合碱组(M组)和七氟烷+野百合碱组(S组)。M组和S组大鼠腹腔注射野百合碱60 mg/kg,CM组大鼠腹腔注射野百合碱溶解剂。注射野百合碱后第1天时S组和CS组大鼠吸入2.5%七氟烷1 h,每周2次,每次间隔3 d。野百合碱注射后6周应用小动物经胸超声心动图法测定肺动脉加速时间和肺动脉射血时间。在3%七氟烷麻醉下暴露小鼠胸腔,灌注心脏,留取肺动脉分支血管和右心室心肌组织。HE染色观察肺小动脉管壁厚度和右心室心肌细胞横截面积,Western blot法检测右心室心肌细胞Ca^(2+)转运蛋白的表达。结果与CM组相比,M组大鼠肺动脉加速时间和肺动脉射血时间比值减小,右心室心肌细胞横截面积增大,肺小动脉管壁厚度增加,1型钠钙交换体和三磷酸肌醇受体表达上调,L-型电压依赖钙离子通道α1C亚基、兰尼碱受体、肌浆网钙泵2α和亲联蛋白-2表达下调(P<0.01);与M组相比,S组大鼠肺动脉加速时间和肺动脉射血时间比值升高,右心室心肌细胞横截面积减小,肺小动脉管壁厚度减少,1型钠钙交换体和三磷酸肌醇受体表达下调,L-型电压依赖钙离子通道α1C亚基、兰尼碱受体、肌浆网钙泵2α和亲联蛋白-2表达上调(P<0.01)。结论七氟烷改善肺动脉高压大鼠右心室重构的机制与调节心肌细胞Ca^(2+)转运蛋白表达有关。

急性肝衰竭犬模型肝细胞膜表面OATP1及MRP2蛋白表达与钆塞酸二钠增强MRI信号强度的相关性分析

目的探讨钆塞酸二钠(Gd-EOB-DTPA)增强MRI信号强度与肝细胞膜表面有机阴离子转运多肽1(OATP1)及多药耐药相关蛋白2(MRP2)表达的相关性。方法选取健康成年雄性Beagle犬16只,随机分成对照组(n=8)和急性肝衰竭组(n=8)。急性肝衰竭组造模24 h后进行Gd-EOB-DTPA增强MRI扫描,测量肝实质不同信号区域信号强度及首过快速上升期中的增强斜率百分比,根据肝细胞期(注射Gd-EOB-DTPA 20 min时)的MRI图像选择高、中、低信号区域进行肝穿刺。对照组采用同样方法注射等剂量生理盐水后行Gd-EOB-DTPA增强MRI扫描,并在相应区域进行肝穿刺。将穿刺取得的肝组织用于Western Blot检测Gd-EOB-DTPA的摄取蛋白OATP1及排泄蛋白MRP2的表达情况。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验,同一信号区不同组OATP1、MRP2蛋白表达的比较采用两个独立样本t检验。蛋白表达水平与信号强度的相关性采用Pearson分析。结果急性肝衰竭Beagle犬通过Gd-EOB-DTPA行MRI增强扫描在肝细胞期时图像呈现明显的高、中、低不同区域的信号差异,对应的SIbase值、SIst值、首过快速上升期中的增强斜率百分比对比差异有统计学意义(F值分别为70.70、55.12、19.82,P值均<0.001)。急性肝衰竭组不同MRI信号区域的肝组织中OATP1及MRP2的表达存在差异(F值分别为7.508、6.212,P值均<0.01),中、低不同信号区OATP1的表达与对照组相比呈逐渐下降的趋势(中、低信号区t值分别为3.301、3.641,P值均<0.05),并与肝细胞期信号减低的趋势相一致,以低信号区表达为著(高、低信号区对比t=3.436,中、低信号区对比t=2.378,P值均<0.05),差异具有统计学意义。急性肝衰竭组高、中、低不同信号区MRP2的表达与对照组相比均升高,且高、中、低信号区成逐渐升高的趋势,差异有统计学意义(t值分别为-7.236,-8.130、-9.614,P值均<0.05)。结论肝细胞膜表面OATP1、MRP2的表达水平与肝实质在Gd-EOB-DTPA增强肝细胞期的强化程度具有一定的关系,这为节段性评估肝细胞功能提供一定依据。

微小RNA-195降低寡聚态β样淀粉蛋白1-42诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞炎症反应和凋亡作用机制

目的探讨微小RNA-195(miR-195)对寡聚态β样淀粉蛋白(Aβ)1-42诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞(PC12细胞)炎症反应和凋亡的作用机制。方法本研究起止时间为2018年3—11月。PC12细胞购自美国模式培养物保藏中心。运用25μmol/mL的Aβ1-42处理PC12细胞建立神经细胞损伤模型;将PC12细胞分为Aβ1-42+miR-con组、Aβ1-42+miR-195组、Aβ1-42+si-con组、Aβ1-42+ATP酶阳离子转运13A2小干扰RNA(si-ATP13A2)组、miR-con组、miR-195组、Aβ1-42+miR-195+pcDNA组、Aβ1-42+miR-195+ATP13A2过表达质粒(pcDNA-ATP13A2)组。实时定量PCR检测细胞中miR-195、ATP13A2的mRNA的表达;Western blotting检测细胞中ATP13A2的蛋白表达;酶联免疫吸附实验检测细胞中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;噻唑蓝法、流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞中miR-195与ATP13A2的结合力。结果与对照组相比,Aβ1-42可显著下调PC12细胞中miR-195的表达[(0.22±0.04)比(1.01±0.06)],上调ATP13A2的表达[(0.78±0.08)比(0.41±0.05)];过表达miR-195可促进PC12细胞的增殖[(76.59±8.44)%比(52.73±5.82)%],抑制凋亡[(17.76±1.87)%比(26.56±2.12)%],抑制IL-1β[(875.28±118.47)pg/mL比(1753.84±215.92)pg/mL]、TNF-α[(185.32±23.27)pg/mL比(268.75±27.67)pg/mL]的表达;沉默ATP13A2可促进PC12细胞的增殖[(78.59±9.76)%比(53.59±6.46)%],抑制凋亡[(18.03±1.82)%比(24.73±2.55)%],抑制IL-1β[(953.64±105.28)pg/mL比(1880.77±238.49)pg/mL]、TNF-α[(152.81±22.46)pg/mL比(258.40±28.16)pg/mL]的表达。miR-195可抑制野生型ATP13A2细胞的荧光活性,且可负向调控ATP13A2的表达;过表达ATP13A2可逆转miR-195对Aβ1-42处理的PC12细胞的抗炎、增殖促进和凋亡抑制作用。结论miR-195可抑制寡聚态Aβ1-42诱导PC12细胞的炎症反应和凋亡,其机制与靶向ATP13A2有关,将可为阿尔茨海默病的治疗提供新靶点。

镁离子及其转运蛋白在肿瘤中的研究进展

近年来有研究发现,肿瘤细胞中普遍存在镁离子的稳态失衡,镁离子的缺失和补充可以影响肿瘤的发生和发展。镁离子作为细胞内丰富的二价阳离子,其在维持遗传稳定性、新陈代谢、细胞生长增殖和信号转导等生理过程发挥着重要作用。镁离子稳态受多种转运蛋白调控,有关镁离子转运蛋白的表达变化导致镁离子稳态失衡,进而影响肿瘤发生、发展及预后的研究报道已引起广泛关注。本文就镁离子及其相关转运蛋白[镁离子瞬时受体电位通道(transient receptor potential melastatin,TRPM)蛋白、镁离子转运(magnesium transporter,MagT)蛋白、细胞周期素和胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase,CBS)结构域金属离子转运介质(cyclin and CBS domain divalent metal cation transport mediator,CNNM)蛋白和溶质载体(solute carrier,SLC)蛋白等]在肿瘤中的相关报道作一综述,旨在探索镁离子及其转运蛋白能否成为肿瘤诊断、治疗及预后的新靶点提供一条新的思路。

稳定表达Keap1的H460-N5细胞株的建立及增敏抗肿瘤药物作用的研究

目的:建立野生型Keap1过表达的H460细胞株降表达Nrf2,检测Nrf2-ARE信号通路对肿瘤细胞耐药性的影响。方法:H460细胞转染mKeap1-pEGFP后经过长期筛选得到稳定表达Keap1蛋白质的细胞株,通过Western blotting和荧光定量PCR的方法进行检测;并通过多次继代培养,细胞株H460-N5稳定表达mKeap1,Nrf2及其调控基因均显著降表达;用MTS法检测抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷对细胞增殖抑制率。结果:H460细胞转染mKeap1-pEGFP后筛选建立Nrf2降表达的稳定细胞株H460-N5。MTS数据显示,与对照组相比,抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷对H460-N5细胞的抗增殖作用更显著。当奥沙利铂和依托泊苷分别在93μmol/L和100μmol/L浓度作用于对照组细胞株H460-N0时,药物作用接近半数抑制率(IC50);而在H460-N5细胞株中,两种抗癌药物的IC50分别为42μmol/L和30μmol/L。阿霉素对H460-N0细胞的IC50>3 mg/L,而对H460-N5细胞的IC50约为2 mg/L。结论:Keap1过表达的H460-N5细胞Nrf2及调控基因显著降低并增敏抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷对肿瘤细胞的增殖抑制作用。

细菌内同源重组构建携带人DMT1基因的重组腺病毒

目的利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1(DMT1)编码基因的重组腺病毒。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1-IRE的cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-DMT1-IRE,在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组,利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆,经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1-DMT1-IRE。线性化的重组质粒转染HEK293细胞,获得高滴度的重组腺病毒。结果RT-PCR反应扩增出1841 bp的片段,重组质粒阳性克隆pAdEasy1-DMT1-IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20 kb的大片段和4.5 kb的特征性片段,PCR鉴定扩增出DMT1的片段,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因DMT1-IRE。转染293细胞后细胞表达GFP荧光,显示293细胞稳定表达外源性的DMT1-IRE基因。结论携带DMT1-IRE基因的重组腺病毒质粒构建成功,获得高滴度的重组腺病毒,为DMT1基因进一步功能的研究提供基础。

^(99m)Tc-TRODAT-1脑SPECT显像对帕金森病的早期诊断价值

目的:评价脑99Tcm-2β[N,N′-双(2-巯乙基)乙撑二胺基]甲基,3β-(4-氯苯基)托烷(99mTc-TRODAT-1)SPECT多巴胺转运蛋白(dopamine transporter,DAT)显像对帕金森病(Parkinson′s disease,PD)早期诊断的临床应用价值。方法:对21例早期PD患者(Hoehn-Yahr 1级12例,2级9例)及15例健康对照者分别进行99mTc-TRODAT-1SPECT脑显像,剂量为740 MBq。应用计算机感兴趣区技术及2个数学模型分别计算早期PD患者及健康对照者双侧纹状体体积(V,cm3)、质量(W,g),代表相应部位的多巴胺转运蛋白功能水平。结果:健康对照组SPECT扫描示DAT核素密度集中于双侧纹状体呈红色,左右基本对称,双侧纹状体貌似“熊猫眼”。早期PD患者双侧纹状体DAT核素分布不均匀,形状各异,其体积和质量均低于健康对照者,差异有显著性(P<0.01);早期PD患者症状对侧纹状体体积和质量均显著低于症状同侧(P<0.01);Hoehn-Yahr 2级PD患者双侧纹状体DAT体积和质量均低于Hoehn-Yahr 1级PD患者,差异有显著性(P<0.05)。结论:DAT数量减少是PD发病的重要环节之一,99mTc-TRODAT-1脑SPECT显像有助于PD的早期临床诊断。

枸橼酸铁铵对BV2小胶质细胞DMT1和FPN1表达影响

目的观察枸橼酸铁铵(FAC)对BV2小胶质细胞二价金属离子转运蛋白1(DMT1)和铁转出蛋白1(FPN1)表达的影响。方法以100μmol/L的FAC处理BV2小胶质细胞24h,采用Western Blot方法观察细胞内DMT1和FPN1蛋白表达的变化。结果 FAC处理BV2小胶质细胞24h后,FAC组DMT1蛋白表达与对照组比较明显下调(t=3.880,P<0.01),但FPN1蛋白的表达明显上调(t=4.409,P<0.01)。结论 FAC处理BV2小胶质细胞24h,可使细胞中DMT1蛋白表达下调,FPN1蛋白表达上调,此过程可能与铁调节蛋白的调控有关。

瑞芬太尼诱发切口痛大鼠痛觉过敏时脊髓二价金属离子转运体1表达的变化

目的评价瑞芬太尼诱发切口痛大鼠痛觉过敏时脊髓二价金属离子转运体1（DMT1）表达的变化。方法雄性sD大鼠32只，体重240～260g，2～3月龄，采用随机数字表法分为4组（n=8）：对照组（C组）静脉输注生理盐水0．1ml·kg-1·min-1 60min；切口痛组（I组）建立大鼠切口痛模型，同时静脉输注生理盐水1．0μg．kg-1·min-1 60min；瑞芬太尼组（R组）静脉输注瑞芬太尼1．0μg．kg-1·min-1 60min；切口痛＋瑞芬太尼组（I＋R组）建立大鼠切口痛模型，同时静脉输注瑞芬太尼1．0μg．kg-1·min-1 60min。分别于静脉输注生理盐水或瑞芬太尼前24h、输注结束后6、24和48h（T0-3）时测定机械缩足反应阈（MWT）和热缩足潜伏期（TwL）。最后一次测定痛阂后处死大鼠，取脊髓组织，采用Western blot法和免疫组化法测定铁反应元件阴性二价金属离子转运体1[DMT1（-）IRE]和铁反应元件阳性二价金属离子转运体1[DMT1（＋）IRE]的表达。结果与C组比较，I组、R组和I＋R组T1-3时MWT降低，TwL缩短，脊髓DMT1（-）IRE表达上调（P〈0．05）；与I组和R组比较，I＋R组T1-3时MWT降低，TWL缩短，脊髓DMT1（-）IRE表达上调（P〈0．05）。4组脊髓DMT1（＋）IRE表达比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论瑞芬太尼诱发切口痛大鼠痛觉过敏的机制可能与激活脊髓DMT1（-）IRE有关。

人OCTN2基因片段的克隆及其GST融合蛋白的原核表达

目的从人附睾组织中克隆OCTN2基因,构建PGEX-2T-OCTN2载体,原核表达人OCTN2重组蛋白。方法应用RT-PCR方法从人附睾组织中克隆OCTN2,利用ECoRⅠ和BamHⅠ酶切位点把OCTN2克隆到PGEX-2T载体,酶切和测序鉴定后,大量诱导重组蛋白并回收。结果从人附睾组织中克隆到人OCTN2的基因片段,构建了PGEX-2T-OCTN2载体,表达了预期相对分子质量的融合蛋白并大量回收。结论成功克隆OCTN2,表达并大量回收其融合蛋白,为制备人OCTN2特异性抗体、进一步研究附睾肉碱转运机制奠定了前期基础。

由药物转运体介导的药物与二甲双胍相互作用的处方分析

目的从药物转运体的角度分析含二甲双胍门诊处方合并其他用药的潜在药物相互作用。方法收集海南省人民医院2019年7-12月门诊所有含二甲双胍处方,参照药品说明书、Drugbank、Pubmed等数据库分析处方中合并用药与二甲双胍的潜在相互作用。结果共收集含二甲双胍门诊处方15 568张,其中男性患者、女性患者处方分别为9 146、6 422张。联合用药处方14 902张,联合用药种类主要包括其他降糖药、抗血小板药、降压药、降脂药、神经保护药。药物转运体层面与二甲双胍联用具有潜在相互作用的包括阿司匹林、阿托伐他汀钙、瑞格列奈、比索洛尔、美托洛尔、氯吡格雷,共11 614次。其中通过抑制有机阳离子转运体1(OCT1)共5 938次;通过抑制OCT2共5 676次。结论该院含二甲双胍门诊处方与其常联用的慢性病治疗药不存在配伍禁忌,但门诊医生对潜在相互作用导致的剂量调整认识度不足。

Citrin缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症家系SLC25A13基因突变研究

目的探讨一个来自中国的 Citrin 缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症(NICCD,MIM#605814)家系的基因诊断过程。方法从先证者及其所在家系其他9名成员的血样中提取 DNA,PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳,初步发现2个突变,并用本实验室建立的基因扫描法进一步证实,然后行DNA 测序,最终确定突变位置和性质。结果先证者为851-854del 和1638-1660dup 两种突变的复合杂合子,两种突变分别位于 SLC25A13基因外显子9和外显子16。母亲及哥哥为851-854del 携带者,父亲、一个姑姑及其子为1638-1660dup 携带者。结论该家系中 SLC25A13基因外显子9和16分别发生了缺失突变851-854del 和插入突变 1638-1660dup。

小儿胆汁淤积性肝病的病因学特征

目的研究胆汁淤积性肝病（CLD）患儿的主要病因学特征，并探讨SLC25A13基因突变类型在CLD的分子流行病学分布。方法2003年10月至2009年3月问我科诊治的CLD患儿63例，其中男36例，女27例。采用临床横断面研究，收集整理研究对象的临床资料，分析总结其病因及临床转归；应用课题组已建立方法常规筛查SLC25A13基因的13～17种突变类型；在部分患儿中通过基因组DNA直接测序寻找SLC25A13基因突变。结果63例CLD患儿中有24例病因不明，另外39例病因明确。在已明确的CLD病因中，遗传代谢病居首位，包括citrin缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症（NICCD）、暂时性半乳糖血症、酪氨酸血症Ⅰ型、半乳糖激酶缺陷病、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷病和糖原累积病Ⅰ型等6种疾病共27例患儿，其中NICCD 21例；其次是获得性因素，包括全胃肠道外营养相关胆汁淤积症、巨细胞病毒肝炎和先天性梅毒共7例；再次为先天性胆道畸形，包括胆道闭锁、Caroli病和胆囊息肉共5例。55例随访CLD患儿中有10例已夭折，其余45例临床改善或痊愈。44例CLD患儿接受了SLC25A13突变分析，其中来自20个家庭（共40个等位基因）的21例患儿被发现携带基因突变。检测到的7种突变类型分别为851—854del（23／40），IVS6＋5G〉A（6／40），IVS16ins3kb（3／40），1638—1660dup（2／40），A541D（1／40），R319X（1／40）和G333D（1／40），还有3个等位基因中的新突变有待识别（3／40）。结论虽部分CLD患儿病因不能明确，但遗传代谢病，尤其是NICCD，是CLD的常见病因。少数CLD患儿预后不良，但大部分患儿可获临床改善甚至痊愈。本组检测到SLC25A13基因突变类型7种，其中前4位最常见者依次是851—854del，IVS6＋5G〉A，IVS16ins3kb和1638—1660dup。

SLCO1B1/ABCB1基因多态性与抗结核药物性肝损伤的相关性分析

目的探讨肝脏药物转运体(solute carrier organic anion transporter family member 1B1,SLCO1B1)和多药耐药性蛋白(ATP-binding cassette subfamily B member 1,ABCB1)基因多态性与汉族人群抗结核药物性肝损伤的关系。方法采用1∶1配对的病例对照研究设计,选择抗结核治疗致肝损伤者171例为病例组,无肝损伤者171例为对照组。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(polymerase chain reaction and restriction fragmentlength polymorphism,PCR-RFLP)技术,检测171对肺结核病患者SLCO1B1基因388A/G位点和ABCB1基因1236C/T位点多态性情况。采用SPSS 13.0统计软件进行单因素分析。结果 SLCO1B1基因388A/G位点的A、G等位基因频率在病例组为22.8%和77.2%,在对照组分别为25.7%和74.3%;ABCB1基因1236C/T位点的C、T等位基因频率在病例组和对照组相同,均为28.4%和71.6%。单因素分析结果表明,SLCO1B1和ABCB1基因的多态性分布在病例组与对照组间差异均无统计学意义(均有P>0.05),与肝细胞型肝损伤的发生无统计学关系(P>0.05)。结论 SLCO1B1-388A/G和ABCB1-1236C/T基因多态性可能与抗结核药物性肝损伤、肝细胞型肝损伤的发生无相关性。

ABCB1和ABCC2及SLC01B1基因多态性与大剂量甲氨蝶呤化疗毒性作用的相关性

目的探讨三磷酸腺苷结合盒转运体B1（ABCBl）、三磷酸腺苷结合盒转运体c2（ABCC2）和溶质转运蛋白181（SLC0181）基因多态性与急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿大剂量甲氨蝶呤（MTX）化疗毒性作用的相关性。方法病例对照研究。收集2005年9月至2011年12月南京医科大学附属南京儿童医院142例ALL患儿外周血，采用均相酶放大免疫分析法（EMIT）测定MTX血药浓度，采用聚合酶链反应-连接酶检测（PCR—LDR）技术对ABCB1、ABCC2和SLC0181基因单核苷酸多态性（SNPs）进行基因分型。结果MTX存在排泄延迟时，其毒性作用发生风险显著增加（OR=2．828，95％CI：1．217～6．571，P〈0．05），SLC0181基因rs4149081和rs11045879位点存在强连锁不平衡（R2=0．979，P〈0．05）。多因素分析显示，SLC0181基因rs4149081AA或rs11045879CC基因型患儿MTX化疗后易m现排泄延迟（OR=4．41，95％CI：1．537～12．654，P：0．042），且发生MTX毒性作用的风险显著高于其他基因型患儿（OR=4．118，95％CI：1．135—14．944，P=0．022）。未发现其他SNPs与MTX排泄延迟或毒性作用的相关性。结论SLC0181基因rs4149081AA或rs11045879CC基因型可能是MTX毒性作用的危险因素。

NOS-NO-NHE1通路在七氟醚后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用：离体实验

目的 探讨一氧化氮合酶-一氧化氮-钠氢交换蛋白l（NOS-NO-NHE1）通路在七氟醚后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用.方法 取Langendorff灌流模型制备成功的雄性SD大鼠离体心脏72个,采用随机数字表法,将其分为6组（n=12）,假手术组（S组）：连续用K-H液灌注180 min;七氟醚组（Sev组）：K-H液灌注60 min后,用含2.5％七氟醚的K-H液灌注15 min,再用K-H液灌注105 min;缺血再灌注组（I/R组）：K-H液灌注30 min后,停灌30 min,再灌注120 min,制备心肌缺血再灌注损伤模型;七氟醚后处理组（SP组）：于再灌注开始即刻用含2.5％七氟醚的K-H液灌注15min,随后再用K-H液灌注105 min;七氟醚后处理＋NOS抑制剂左旋-硝基精氨酸甲基酯（L-NAME）组（SPL组）：再灌注开始用含浓度为100 μmol/L L-NAME的K-H液灌注60 min,同时在K-H液中通入2.5％七氟醚维持15 min,随后再K-H液灌注60 min; L-NAME组（L组）：再灌注开始即刻用含浓度为100μmol/L L-NAME的K-H液灌注60 min,再换用上述单纯K-H液灌注60 min.于再灌注2h时取心肌组织,采用分光光度法检测NO、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）含量和NOS活性,Western blot法测定总NHE1 （t-NHE1）和磷酸化NHE1（p-NHE1）的表达,RT-PCR法测定NHE1 mRNA的表达水平,并测定心肌梗死体积,观察心肌超微结构.结果 与S组比较,I/R组、SP组、SPL组和L组心肌梗死体积增大,心肌NO、NOS和NAD＋水平降低,p-NHE1及NHE1 mRNA表达上调（P＜0.05）,Sev组上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）;与I/R组比较,SP组心肌梗死体积减小,心肌NO、NOS和NAD＋水平升高,p-NHE1及NHE1 mRNA表达下调（P＜0.05）,SPL组和L组上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）;与SP组比较,SPL组和L组心肌梗死体积增大,心肌NO、NOS和NAD＋水平降低,p-NHE1及NHE1 mRNA表达上调（P＜0.05）.SP组心肌病理学损伤较I/R组和SPL组减轻.结论 七氟醚后处理可能通过增强心肌NOS活性,促进NO合成,抑制NHE1功能,从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤.

UPLC-MS/MS法同时测定人血浆中普拉克索和金刚烷胺浓度

目的:建立利用UPLC-MS/MS法同时测定人血浆中普拉克索和金刚烷胺的分析方法。方法:在碱性条件下,血浆样品经乙酸乙酯萃取。采用Acquity UPLC BEH C_(18)(2.1 mm×50 mm,1.7 m)色谱柱,甲醇(A)-0.01%甲酸水(B)为流动相,梯度洗脱,流速0.2 mL·min^(-1),柱温为30℃;采用电喷雾离子源、正离子方式、多反应监测(RRM),普拉克索离子反应为m/z 212→153,金刚烷胺为m/z 152→135,内标伪麻黄碱为m/z 166→148。结果:普拉克索血浆质量浓度在10～1 200 pg·m L^(-1),金刚烷胺在0.7～700 ng·m L^(-1)内线性关系良好,两者日内、日间RSD均小于9.8%,方法回收率均在100.3%～106.0%之间。所测30例帕金森患者中,普拉克索平均谷浓度为(643.61±243.19)pg·mL^(-1),金刚烷胺平均谷浓度为(551.67±81.14)ng·mL^(-1)。结论:建立的检测方法可用于同时测定人体血浆中普拉克索和金刚烷胺的浓度。